研究背景:肾小球疾病是以肾小球变态反应性炎症为主要特点的泌尿系统疾病,其中足细胞损伤是肾小球肾炎起始阶段的重要事件,足细胞形态、功能异常以及大量凋亡会严重破坏肾小球的过滤屏障功能,引起以大量蛋白尿、低蛋白血症和高脂血症为主要临床表现的肾病综合征。因此探讨肾小球足细胞损伤的发生发展机制并寻找有效的治疗靶点,具有较高的临床意义和科研价值。Plectin蛋白是一种在肾小球足细胞中广泛表达的细胞骨架蛋白,具有哑铃状结构,包含一个中央的200 nm长的杆状结构域和两侧的球状结构域,这种多域结构使plectin蛋白能够与大量不同的蛋白质相互作用并显著影响其功能。由于plectin蛋白在维持细胞正常形态、骨架稳定以及结构完整方面发挥重要作用,其表达异常可能会直接影响到足细胞形态和功能,进而影响肾小球的滤过功能。除了起到连接作用外,plectin蛋白在涉及肌动蛋白(actin)细胞骨架动态调整的生理过程中也起到关键作用。此外,plectin蛋白还可作为信号转导分子的支架平台,如整合素α6β4(integrin α6β4)和粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK),这已经成为研究人员关注的一个有趣的新方面。FAK在各种细胞模型、多种细胞功能中,均被证实为整合素蛋白信号转导的关键介质。在被整合素蛋白激活后,FAK经过自身磷酸化作用,与其他细胞蛋白形成复合物,并通过其激酶活性触发下游信号传导。既往研究已显示FAK和下游p38MAPK信号通路在阿霉素(adriamycin,ADR)诱导的足细胞凋亡和F-肌动蛋白(F-actin)细胞骨架重构中发挥重要作用。前期研究发现ADR诱导的肾病模型中肾小球plectin蛋白表达严重缺乏,本研究旨在评估该蛋白在ADR诱导的足细胞凋亡和F-actin细胞骨架重排中的作用,并探讨其与integrin α6β4、FAK和p38MAPK信号通路的关系。阿霉素诱导的足细胞损伤模型具有明显的足突融合或消失、细胞凋亡、蛋白表达改变等足细胞损伤的典型表现,同时,阿霉素大鼠肾病模型的病理生理改变也类似于人类微小病变型肾病综合征的改变,此两种模型在基础研究中的应用均较为广泛。因此,本研究以阿霉素诱导的足细胞损伤模型和阿霉素大鼠肾病模型作为研究对象,观察并探讨plectin蛋白和integrin α6β4/FAK/p38 MAPK信号通路的激活在阿霉素诱导的足细胞损伤及阿霉素肾病蛋白尿发生过程中的作用,为临床早期预防和治疗肾病蛋白尿提供新的思路和理论依据。研究目的:1.明确在阿霉素诱导的足细胞凋亡及F-actin细胞骨架紊乱中plectin蛋白的变化情况及作用。2.探讨阿霉素诱导的足细胞凋亡及F-actin细胞骨架紊乱中涉及到plectin蛋白的相关信号通路及其引起足细胞损伤的作用机制。3.观察阿霉素肾病动物模型中肾小球足细胞形态和数量的改变,plectin及下游信号通路蛋白的表达变化情况。研究方法:1.细胞培养:体外培养永生化小鼠足细胞系。使用I型胶原蛋白包被的细胞培养皿,将足细胞置入含有10%胎牛血清的RPMI 1640+100 U/ml青霉素+100 mg/ml链霉素+10U/ml重组小鼠γ-干扰素中,于33 ℃下培养足细胞增殖。后将足细胞转移到37℃条件下,在不含有重组小鼠γ-干扰素的培养基中继续培养14天,足细胞分化成熟。2.建立阿霉素肾病大鼠模型:购买雄性Sprague-Dawley大鼠20只(200g±20g),大鼠被安置在温度控制的房间,自然光线照明,循昼夜规律,通风良好,并提供可以自由获得的食物和水,将这些大鼠随机分为两组(n=10,每组):阿霉素组和正常对照组。阿霉素组通过尾静脉单次注射7.5mg/kg的阿霉素来建立肾病模型大鼠,正常对照组注射同剂量的生理盐水,实验期间没有大鼠死亡。注射后第4周结束饲养并将大鼠安乐死,处死前记录体重,利用代谢笼收集每只大鼠的24小时尿液,以测定24小时尿量和24小时尿蛋白,从腹主动脉收集血液,离心制备血清,-20℃保存。3.检测阿霉素刺激足细胞后plectin蛋白的表达、ROS的水平以及足细胞损伤指标的变化:(1)western blot、实时定量PCR和流式细胞术检测在不同阿霉素浓度和干预时间点下足细胞中plectin蛋白的表达情况以及ROS的水平,并确定特定的阿霉素浓度和干预时间来进行后续的细胞分子实验;(2)鬼笔环肽-荧光素染色实验观察阿霉素刺激足细胞后F-actin细胞骨架结构的改变;(3)流式细胞术检测阿霉素诱导的足细胞凋亡情况;(4)western blot实验检测阿霉素干预的足细胞中损伤标志物蛋白WT1、synaptopodin和desmin的表达水平;(5)western blot和流式细胞术检测应用线粒体保护剂后阿霉素刺激的足细胞中ROS水平和plectin蛋白的表达情况;4.检测plectin蛋白在阿霉素诱导的足细胞损伤中的作用:(1)利用包含plectin cDNA的质粒转染足细胞,以使阿霉素刺激的足细胞中plectin表达上调至正常水平,进而利用流式细胞术、细胞免疫荧光染色和western blot技术检测足细胞凋亡率变化情况、足细胞F-actin细胞骨架变化以及足细胞特异性标志物蛋白WT1、synaptopodin和desmin的变化情况;(2)plectin特异性小干扰RNA(siPlectin)转染足细胞后,利用流式细胞术、细胞免疫荧光染色和western blot技术检测足细胞凋亡率变化情况、足细胞F-actin细胞骨架变化以及足细胞特异性标志物蛋白WT1、synaptopodin和desmin的变化情况。5.检测plectin蛋白调控的相关信号传导通路及其在足细胞损伤中的作用机制:(1)western blot实验检测阿霉素诱导的足细胞损伤中integrinα6β4、FAK和p38总蛋白表达量以及磷酸化水平;应用siPlectin后足细胞中integrin α6β4、FAK和p38的总蛋白表达量、磷酸化水平。(2)western blot实验检测在阿霉素诱导的足细胞中通过质粒转染技术恢复plectin表达后,integrin α6β4、FAK和p38的表达量和磷酸化水平的变化情况。(3)western blot实验和流式细胞术检测在应用siPlectin后足细胞中integrin α6β4、FAK和p38的表达量、磷酸化水平以及细胞凋亡率的时间-过程效应。(4)western blot实验检测在转染Y1494位点突变的integrin α6β4后再给予siPlectin,FAK和p38表达量与磷酸化水平、足细胞的凋亡率、细胞骨架变化情况以及损伤标志物蛋白WT1、synaptopodin和desmin的表达量变化情况。(5)western blot实验、流式细胞术和免疫荧光染色检测应用FAK的Y397位点抑制剂后再给予siPlectin,integrin α6β4和p38的表达量与磷酸化水平、足细胞的凋亡率、细胞骨架变化情况以及损伤标志物蛋白WT1、synaptopodin和desmin的表达量。(6)western blot实验、流式细胞术和免疫荧光染色检测应用p38特异性抑制剂后再给予siPlectin,integrin α6β4和FAK的表达量与磷酸化水平、凋亡蛋白Bax和caspase-3表达量、细胞骨架调节子synaptopodin表达量、细胞凋亡率以及细胞骨架变化。6.检测阿霉素肾病大鼠模型中肾损伤指标、plectin蛋白及其相关信号通路蛋白的表达:(1)大鼠尾静脉注射阿霉素造模成功后,记录模型组和对照组大鼠的体重、24小时尿量、24小时尿蛋白定量、血尿素氮和血清肌酐水平。(2)光镜下观察模型组大鼠肾脏的肾小球、肾小管-间质区域的组织学改变。(3)电镜下观察模型组大鼠足细胞形态学改变。(4)western blot实验检测模型组和对照组中足细胞标志物蛋白WT1、synaptopodin和desmin表达量。(5)western blot和免疫组化染色检测肾皮质中plectin蛋白量和定位。(6)western blot实验检测模型组和对照组中integrin α6β4、FAK和p38的表达量和磷酸化水平以及凋亡调节蛋白Bax和caspase-3表达量。结果:1.0.5μg/ml的阿霉素干预足细胞12小时后,可见足细胞的F-actin细胞骨架结构紊乱,向外周崩塌,足细胞凋亡率也较正常对照组明显升高(P<0.01)。另外,足细胞经典的标志物蛋白WT1和synaptopodin较正常对照组明显减少(P<0.01),足细胞损伤标志蛋白desmin较正常对照组明显增多(P<0.01)。2.0.5μg/ml的阿霉素干预足细胞1小时、2小时、4小时、6小时及12小时后,线粒体氧化应激产生的ROS均明显升高(P<0.01),但plectin表达量在4-6小时期间才明显升高(P<0.05),足细胞凋亡率也在4-6小时期间才明显升高(P<0.05),应用线粒体保护剂后,plectin蛋白表达量较单纯阿霉素干预组明显恢复(P<0.01)。将转染plectin cDNA质粒的阿霉素干预组与单纯阿霉素干预组相比,足细胞的凋亡率明显下降(P<0.01),F-actin细胞骨架紊乱程度减轻,WT1和synaptopodin的表达量明显升高(P<0.01),desmin的表达量明显下降(P<0.01)。而转染siPlectin的正常足细胞则出现严重的细胞凋亡和细胞骨架紊乱,WT1和synaptopodin的表达量明显下降(P<0.01),desmin的表达量明显增加(P<0.01)。3.阿霉素干预足细胞可引起细胞内integrin α6β4、FAK和p38的磷酸化水平明显升高(P<0.01),而对阿霉素干预的足细胞转染plectincDNA质粒,可抑制integrin α6β4、FAK和p38的磷酸化水平升高并减轻细胞损伤,对正常足细胞转染siPlectin则能模拟出阿霉素引起的integrin αα6β4、FAK和p38磷酸化水平升高(P<0.01)。对足细胞转染siPlectin的时间-过程效应实验则显示出integrin α6β4、FAK和p38的磷酸化水平依次升高,足细胞凋亡率也随着p38磷酸化水平升高而增加。转染integrin β4 Y1494位点突变的质粒能阻止siPlectin引起的FAK和p38磷酸化水平升高;给予FAK抑制剂能阻止siPlectin引起的p38磷酸化水平升高,但不会影响integrin α6β4磷酸化水平升高;给予p38抑制剂则不能阻止siPlectin引起的integrin α6β4和FAK磷酸化水平升高,但是可以抑制由siPlectin引起的Bax和caspase-3蛋白表达。FAK和p38抑制剂均可改善由siPlectin引起的WT1、synaptopodin和desmin蛋白表达异常。4.大鼠尾静脉注射阿霉素后,肾小球萎缩和丢失,肾小球系膜细胞增殖和肾小球系膜基质沉积增加,足突融合。与正常对照组足细胞相比,特异性标志物蛋白WT1和synaptopodin表达减少(P<0.01),损伤标志蛋白desmin表达增加(P<0.01),凋亡标志物蛋白Bax和caspase-3表达增加(P<0.01),信号通路蛋白integrin α6β4、FAK和p38的磷酸化水平升高(P<0.01)。结论:1.阿霉素通过线粒体氧化应激来抑制plectin蛋白表达,plectin蛋白表达的减低在阿霉素引起的足细胞凋亡率增加和细胞骨架紊乱中发挥关键作用。2.Plectin蛋白表达的减少激活了 integrin α6β4/FAK/p38MAPK信号传导通路,信号通路蛋白的磷酸化水平升高,通路靶蛋白中的凋亡调节蛋白Bax和caspase-3表达增加,细胞凋亡增多;通路靶蛋白中的细胞骨架调节子synaptopodin表达减少,细胞骨架紊乱。3.阿霉素肾病大鼠模型中可观察到肾小球基底膜病理改变和足细胞形态异常,plectin 蛋白减少,Bax 和 caspase-3 蛋白增多,integrin α6β4、FAK 和 p38MAPK蛋白磷酸化水平升高,与体外实验的结果相一致。