贝类养殖水域细菌群落动态变化特征及长牡蛎含CARD基因免疫功能的初步研究

来源 :大连海洋大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:xy6905
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海水贝类养殖是我国养殖业重要组成部分。随着养殖技术的成熟,养殖规模不断增大,其经济与社会效益日益凸显。然而,近年来贝类疾病爆发频繁,给贝类养殖产业造成巨大经济损失,严重制约了贝类产业的可持续发展。贝类病害的发生是病原、宿主与环境三者间相互作用的结果,而细菌感染是导致贝类死亡的主要原因之一。因此,对贝类养殖水域细菌群落动态变化及宿主免疫基因的研究,从微生态和宿主两个层面揭示贝类疾病发生原因,具有重要的理论和实践意义。本论文分别以长海县贝类养殖水域微生物和长牡蛎为研究对象,利用高通量测序、分子生物学和免疫学等手段,研究了贝类养殖水域细菌群落的动态变化,细菌群落与环境因子的内在联系、贝类相关致病菌的变化与贝类疾病发生之间的相关性、以及长牡蛎中含CARD基因的免疫学功能。研究结果如下:分析了黄海北部海域贝类养殖区Q点、Z1点和Z2点三个区域2016年11月至2017年8月份之间水体中细菌群落的时空动态变化特征:多样性分析结果表明细菌群落存在明显的季节差异,春夏两季的细菌丰度明显高于秋冬两季。三个地区的优势菌门基本相同,其中变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、放线菌门(Actinobacteria)和浮霉菌门(Planctomycetes)约占养殖区菌群总丰度的90%以上。在目的分类水平上,包含有大量未分类细菌和非可培养细菌,说明在贝类养殖系统中存在许多潜在的细菌新物种和贝类致病菌。基于属的分类水平进行聚类分析表明,同一养殖区不同采样季节的优势菌群不同,在同一季节不同采样位点的优势菌属也存在明显差异。对细菌群落与环境因子的冗余分析(Redundancy analysis,RDA)表明,贝类养殖环境中的温度、溶解氧、叶绿素a是影响3个区域细菌群落结构的主要因素。致病菌基因拷贝数的变化表明,在三个养殖区贝类常见致病细菌灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)在5、6、7三个月其数量均升高。以上数据分析表明,贝类疾病的发生可能与环境因子影响下的菌群变化导致的致病菌的丰度急剧升高有关,从而增加贝类疾病发生率。从长牡蛎中鉴定和克隆得到一个新的含CARD基因(CgCARDCP-1),其开放阅读框(ORF)为759 bp,编码含253个氨基酸的肽段,其编码的蛋白分子量约为28.79 kDa。在CgCARDCP-1的N端存在一个CARD结构域,在C端存在两个PC4结构域。多序列比对分析结果表明CgCARDCP-1与其他物种中的caspase-2具有30%-46%的相似性。进化树分析表明CgCARDCP-1与其他无脊椎动物中的含有CARD结构域的分子聚为一类。组织分布表明CgCARDCP-1在各个组织中均有分布,且主要分布在外套膜和血淋巴细胞中。血细胞定位分析表明,CgCARDCP-1主要分布于细胞质中,少量分布于细胞核中。此外,通过对长牡蛎进行免疫刺激,在mRNA的水平上检测CgCARDCP-1可以显著的响应LPS和灿烂弧菌的免疫刺激。体外的PAMPs结合实验表明,重组CgCARDCP-1蛋白呈现出对LPS结合活。将CgCARDCP-1转染进入到HEK-293T细胞后,采用双荧光素酶报告基因检测方法表明,与空白对照组相比,CgCARDCP-1可以显著促进NF-κB信号通路的激活。本研究结果表明CgCARDCP-1可以作为一类新型的模式识别受体参与免疫识别,并且可以参与转录激活的调控。
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