脑胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤,约占颅内所有肿瘤的40-60%。其具有发病率高、预后差和复发率高等特点。目前,临床上主要的治疗手段为手术切除病灶联合术后放化疗,然而患者仍然难以获得较长的生存期。由于肿瘤的发生和生长依赖充足的血液供应,因此,血管靶向治疗被认为是最有效的治疗方法之一,甚至科研机构以此作为药物研发和临床试验的基本原则。但近年来的研究发现,抗血管治疗使肿瘤细胞长时间处于缺氧与缺血环境中,不仅不能有效控制肿瘤甚至可能增加肿瘤的恶性程度,加速肿瘤转移。这些研究提示我们,恶性肿瘤的发生发展还潜藏着其他机制。1999年,Maniotis等发现并提出了血管生成拟态现象(vasculogenic mimicry,VM)。血管生成拟态是一种与经典的内皮细胞依赖的肿瘤血管构成不同的、不需要依赖内皮的、全新的肿瘤微循环模式,是肿瘤细胞为了满足自身生长对血供的需求,通过变形和细胞外基质重塑而形成的一种与血管类似的、具有供血功能的管道结构。目前,已在黑色素瘤、肝癌、侵袭性卵巢癌、胃肠道间质瘤、乳腺癌、胶质瘤、结直肠癌、前列腺癌、喉头、鳞状细胞癌等多种肿瘤组织中发现血管生成拟态的存在。我们实验室研究发现血管生成拟态现象与患者临床的生存预后呈负相关。然而,有关VM形成机制仍然没有十分明确,但自从该概念被提出后,Maniotis等众多研究者相继在不同的肿瘤中发现并证实了血管生成拟态相关信号转导机制的分子,例如：血管内皮细胞钙粘着蛋白(vascularendothelial cadherin, VE-cadherin)、Eph受体酪氨酸激酶A2(Erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma-A2, EphA2)、基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase, MMPs)、磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphoinositide 3-Kinase, PI3K)、层黏连蛋白(Laminin-5 γ2)、血管内皮因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)、缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor, HIF)和组织因子途径抑制因子-2(tissue factor pathway inhibitor-2, TFPI-2)等。上述分子逐渐被深入研究并形成经典的血管生成拟态信号传导通路模型。其中Seftor, R.E等在2001年证明MMP-2和MT1-MMP (MMP-14)的表达能裂解laminin5 γ2链,从而产生分裂片段γ2’和γ2x,促进VM的生成。Hess, A .R等在2003年证明PI3K能调节MT1-MMP,从而影响VM。因此,PI3K、MMPs和LAMC2是VM信号转导通路上的重要分子。组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase, HDAC)是一类对染色体结构修饰和基因表达调控发挥着重要作用的酶,其催化组蛋白的去乙酰化作用,与基因转录抑制密切相关,牵涉到促基因沉默的诸多过程,是抗肿瘤药物设计中的热门靶标。HDACs乙酰化不同种类的细胞核转录因子和蛋白等,抑制多种抑癌蛋白的表达且与多种癌基因密切关联,导致细胞过度增殖和肿瘤发生,有大量文献证实其与血管生成也密切相关；Liby等发现在胶质细胞瘤中HDAC3随着肿瘤恶性程度增高而表达增高,HDAC3可能是胶质瘤细胞增殖所必须的,在胶质瘤细胞的恶性转化和生长过程发挥了重要的作用；有文献研究证明组蛋白去乙酰化酶的抑制剂TSA、SAHA等药物可以通过PI3K等通路抑制肿瘤的周期复制,而目前认为PI3K通路是MMP促成VM的最后通路。另有文献指出HDAC3是HIF-1a的特定反应物；而HIF-1a等是引起VM的最主要因素之一。由此可见,HDAC与血管生成拟态形成的信号通路中多种分子之间存在一定的交叉(crosstalk),然而目前尚无关于其与血管生成拟态之间关系的报道。若能进一步明确HDAC3是否与脑胶质瘤血管生成拟态形成相关,进一步确定HDAC3与血管生成拟态信号通路之间的分子关联,既有利于进一步推动血管生成拟态形成的机制研究进展,又有望获从中得新的治疗靶点和方法,对于临床治疗脑胶质瘤患者具有非常重要的意义。第一章临床数据中脑胶质瘤VM与HDAC3表达的相关性目的分别探讨脑胶质瘤VM和HDAC3表达与临床数据的相关性,并进一步分析血管生成拟态与HDAC3表达之间的关联性。方法收集南方医科大学珠江医院2010-2013年之间102例脑胶质瘤患者的病历资料,并获取相应病理组织。按照标准流程对病理组织进行再次免疫组织化学染色。染色结果将由两位资深病理学专家再次诊断。所有的资料对诊断专家均不公开,诊断标准为2007年世界卫生组织关于中枢神经系统肿瘤分类的方法。102例病历资料入选标准为：1、所有患者均为首次发现罹患胶质瘤且术前未进行任何治疗；2、术中冰冻和术后病理结果一致且均为胶质瘤；3、患者病理信息完整无误。整理患者的临床数据包括年龄、性别、肿瘤大小、KPS评分和肿瘤WHO分级等。对患者的病理组织进行薄层(5μm)多张切片,每例分成两组,一组用于HDAC3免疫组织化学染色,分析HDAC3的表达水平；另一组进行CD34-PAS双重免疫组织化学染色,以鉴定标本中VM。石蜡块剩余部分进行荧光定量即时聚合酶链锁(qPCR)反应分析。染色结果收集完毕后,首先按照VM阳性和阴性结果与病例数据逐一进行统计学分析,然后对HDAC3表达情况与病例资料进行统计学分析,最后分析VM与HDAC3之间的关联性。P<0.05在统计学上被认定为差异具有统计学意义。结果1、染色结果显示102例病例中,发现26例对应的病理组织切片中有血管生成拟态结构,占所有病例的25.49%；2、临床数据与血管生成拟态经卡方检验分析显示,在血管生成拟态阳性和阴性两组对比中,肿瘤分级有显著差异(χ2=2.902,P=0.048),而其他临床数据没有明显差异。在高级别脑胶质瘤中血管生成拟态结构出现的频率较高(III级和IV级分别为39.39%和40.43%,而I级和II级分别为0.00%和15.00%)；3、临床数据与HDAC3表达经卡方检验分析显示,在HDAC3表达强阳性、阳性和弱阳性三组比较中,肿瘤分级亦有显著性差(χ2=33.390,P<0.001),而其他临床数据没有明显差异。HDAC3高表达(强阳性和阳性)比例在高级别胶质瘤中高于低级别胶质瘤中(III级和Ⅳ级分别为87.88%和73.91%,而I级和II级分别为20%和27.50%)；4、在血管生成拟态阳性和阴性两组对比中,HDAC3表达强弱各组有明显差异(χ2=6.203,P<0.043)；5、qPCR结果显示,血管生成拟态阳性组中HDAC3的基因表达水平明显高于阴性组,有明显差异(P<0.001)；6、显微镜下血管生成拟态结构计数结果显示,血管生成拟态结构中位数在高表达HDAC3的病理组织中比例更高。结论结果提示血管生成拟态和HDAC3表达与肿瘤分级(WHO)呈正相关,而与患者的一般临床病理特征,如性别、年龄、KPS评分、肿瘤大小等无关；血管生成拟态与HDAC3的表达呈正相关。第二章HIDAC3对胶质瘤U87MG细胞VM形成及其相关分子表达的影响目的建立脑胶质瘤细胞株U87MG的三维培养模型(血管生成拟态细胞模型),观察HDAC3对其血管生成拟态体外形成及其相关分子的影响,体内验证HDAC3与VM的相关性。方法1、使用不同剂量的HDAC3抑制剂和干扰RNA质粒(siRNAs)分别处理正常U87MG细胞后,建立血管生成拟态模型,对比各处理组体外血管生成拟态与正常组的差异。2、使用不同剂量的HDAC3抑制剂和HDAC3 siRNAs分别处理正常U87MG细胞,利用MTT和Transwell实验方法检测HDAC3是否影响胶质瘤瘤细胞的增值侵袭性。3、使用不同剂量的HDAC3抑制剂和HDAC3 siRNAs处理U87MG细胞后,建立血管生成拟态模型,验证LAMC2和MMP-14确实参与血管生成拟态过程。4、使用不同剂量的HDAC3抑制剂和HDAC3 siRNAs分别处理正常U87MG细胞,然后利用qPCR和Western blot检测血管生成拟态相关分子的表达水平,分析HDAC3与血管生成拟态的关系。5、建立裸鼠荷瘤模型,将裸鼠分为U87MG和稳定低表达HDAC3的U87MG组进行喂养,然后利用免疫组化、PAS-CD34双重染色、Western blot等方法验证HDAC3在体内参与血管生成拟态的过程。结果1、U87MG三维培养模型建立成功；2、除siRNA对照组外,处理组细胞形成的管道结构与正常组的对比,网状管道结构的交点数和管道长度均下降；3、处理组细胞均未能形成管道结构；4、qPCR检测VM相关分子：使用HDAC3干扰RNA处理的细胞组与对照及正常组对比,HDAC3 mRNA、MMP-2 mRNA. MMP-14 mRNA、LAMC2 mRNA表达水平均有明显下调。Western blot技术检测VM相关分子：(1)应用HDAC3抑制剂SAHA处理的细胞组与未加入抑制剂的对照组相比,HDAC3蛋白水平、MMP-2蛋白水平、MMP-14蛋白水平、LAMC2蛋白水平均有明显下调。(2)使用HDAC3干扰RNA处理后的细胞组与对照及正常组对比,HDAC3蛋白水平、MMP-2蛋白水平、MMP-14蛋白水平、LAMC2蛋白水平表达水平均有明显下调。4、Western blot和qPCR检测结果显示应用HDAC3抑制剂和siRNAs处理细胞后,LAMC2和MMP2/14的蛋白和mRNA表达量均明显下降。5、荷瘤模型建立成功,离体肿瘤无论在体积还是重量上,稳定低表达HDAC3的U87MG组均低于正常U87MG组；免疫组化鉴定VM结果显示正常U87MG组VM阳性率高于稳定低表达HDAC3的U87MG组；Western blot 和qPCR检测VM相关分子显示,稳定低表达HDAC3的U87MG组的VM相关分子表达量明显低于正常U87MG组。结论1、HDAC3在细胞水平、分子水平、体内均与VM相关。第三章HDAC3参与脑胶质瘤VM的信号转导机制目的初步研究HDAC3参与恶性胶质瘤血管生成拟态的信号转导机制,证明HDAC3通过调控信号通路影响血管生成拟态的形成。PI3K/ERK-MMPs-LAMC2方法1、使用分别处理正常U87MG细胞后,用HDAC3 siRNAs方法检测western blot以及血管生成拟态相关分子MMP-14、HDAC3、ERK、ρ-ERK、Akt、ρ-AktLAMC2的表达,分析PI3K和ERK是否参与HDAC3调节VM的过程；2、使用PI3k抑制剂LY294002以及ERK抑制剂U0126分别或联合处理正常U87MG细胞,然后用方法检测western blot以及血管生成拟HDAC3、ERK、ρ-ERK、Akt、ρ-Akt态相关分子的表达,分析PI3K和ERK如何参与此过程。MMP-14、LAMC2结果1、经过siRNAs处理的U87MG细胞组,血管生成拟态相关分子MMP-14和LAMC2蛋白表达量明显下降,同时可见p-ERK和p-Akt蛋白表达量明显下降,但ERK和Akt未见明显下降；2、使用U0126抑制剂处理的细胞组,p-ERK表达水平明显下降,血管生成拟态相关分子MMP-14和LAMC2蛋白表达水平均有一定程度下降,其他未见变化；使用LY294002抑制剂处理的细胞组,p-Akt蛋白表达水平明显下降,血管生成拟态相关分子MMP-14和LAMC2表达水平均有一定程度下降,其他未见变化；使用U0126和LY294002抑制剂联合处理的细胞组,p-ERK和p-Akt蛋白表达水平均明显下降,血管生成拟态相关分子MMP-14和LAMC2表达水平均有明显下降,其他未见变化；结论ERK和P13K信号通路作为并列的两条独立通路参与血管生成拟态的形成。