【摘 要】
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大白菜(Brassica rapa L.ssp.Pekinensis)在农作物领域中属于常见的经济型农产品,尤其在中国、日本和韩国等亚洲地区被大面积耕种。随着基因工程技术的发展,农杆菌介导的遗传转化体系和基因编辑技术近年来不断地应用于大白菜育种过程中,加快了大白菜育种进程,同时改良了大白菜性状,为大白菜遗传育种研究奠定了实验基础。本研究建立了稳定高效的大白菜遗传转化体系,并将CRISPR/Cas9
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大白菜(Brassica rapa L.ssp.Pekinensis)在农作物领域中属于常见的经济型农产品,尤其在中国、日本和韩国等亚洲地区被大面积耕种。随着基因工程技术的发展,农杆菌介导的遗传转化体系和基因编辑技术近年来不断地应用于大白菜育种过程中,加快了大白菜育种进程,同时改良了大白菜性状,为大白菜遗传育种研究奠定了实验基础。本研究建立了稳定高效的大白菜遗传转化体系,并将CRISPR/Cas9系统成功地应用于大白菜基因编辑。(1)试验材料选择大白菜‘C-24’自交系,构建大白菜孤基因BraA1000785超表达载体,通过农杆菌介导法,筛选农杆菌感受态、农杆菌菌液浓度、乙酰丁香酮浓度(AS)、外植体侵染时间和超声辅助处理等影响因素。由此建立了大白菜遗传转化体系,转化体系如下:农杆菌感受态:GV3101,菌液OD600=0.5,侵染培养基(DM)添加AS浓度为20 mg·L-1,外植体菌液侵染过程15 min且无需超声处理,共培养培养基(MC)添加AS浓度为20 mg·L-1(共培养暗处理48h),外植体在筛选培养基(MS)中诱导抗性愈伤组织和抗性芽分化。获得的抗性苗首先利用潮霉素引物进行PCR检测,再通过GUS染色进一步鉴定,确定目的片段已成功导入大白菜‘C-24’基因组中,阳性株系通过荧光定量PCR(qPCR)分析BraA1000785基因在大白菜叶片中的表达水平。最终该体系经重复试验验证,平均转化效率为10.83%。(2)本研究在大白菜遗传转化体系的基础上进一步建立了大白菜CRISPR/Cas9基因编辑体系,以大白菜孤基因BraSca000221为靶基因,在T0代抗性植株中基因编辑效率为72%,均为杂合突变体。T0代株系经自交获得28株T1代突变体,其中纯合编辑植株占35.7%,杂合编辑植株占64.3%。以上研究结果表明,通过大白菜遗传转化体系,可以利用CRISPR/Cas9系统对大白菜基因组进行单靶点编辑。
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