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文章从以下三部分，就5-苯氧丁基二甲基芹菜素对Kv1.5钾通道的作用及对大鼠肾小球系膜细胞ICl.vol和增殖的影响进行了综述。 第一部分 5-苯氧丁基二甲基芹菜素对Kv1.5钾通道的作用 目的:超速激活延迟整流钾电流(IKur)是人心房肌细胞的主要外向钾电流,能被维拉帕米(verapamil)特异性抑制, IKur在人心房肌细胞的复极化过程中起着重要的作用。本实验着重研究同济基础医学院1515实验室自主合成药物5-苯氧丁基二甲基芹菜素(5-PBDMA)对该电流通道——Kv1.5钾通道IKur电流的作用。 方法:采用转染并能稳定表达 Kv1.5钾通道的HEK293细胞(human embryonic kidney293 cell line,是用5型腺病毒75株系转化,含有人胚肾亚三倍体细胞系)作为实验对象,进行电生理实验,采用全细胞膜片钳技术,记录5-PBDMA对 Kv1.5钾通道的作用。 结果:10μmol/L特异性抑制剂维拉帕米能够明显抑制记录到的快速激活外向电流,抑制到 DMSO空白对照组的13±5％,洗脱后电流可部分恢复——该快速激活的外向电流就是 IKur;受试药5-PBDMA(0.01、0.03、0.1、0.3、1、3μmol/L)浓度依赖性地抑制该电流,抑制率为别为6.8±2.9％(n=7)、20.4±4.5％(n=7)、34.6±4.3％(n=5)、57.0±7.7％(n=9)、75.2±8.5％(n=6)、89.7±1.7％(n=5),IC50为0.26μmol/L。 结论:5-PBDMA对 HEK293细胞上表达的Kv1.5钾离子通道电流 IKur具有较强的阻断作用,且该阻断作用具有明显的浓度依赖性。 第二部分 5-PBDMA对大鼠源肾小球系膜细胞容积依赖性氯离子通道电流的影响 目的:容积敏感性氯电流(ICl.vol)是一种与细胞容积密切相关的氯离子电流,在多项研究中被证明与细胞的增殖、分化、凋亡过程、容积调节、酸度调节都密切相关;治疗恶性肾小球疾病可以从抑制肾小球系膜细胞的恶性增殖着手。本实验研究5-PBDMA对ICl.vol的抑制作用。 方法:采用品系为 HBZY-1的大鼠源肾小球系膜细胞,用全细胞膜片钳技术,进行电生理实验,低渗溶液激活电流并在显微镜下观察细胞形态,记录不同浓度受试药5-PBDMA对电流的作用。 结果:1、系膜细胞处于低渗环境中,可明显观察到细胞肿胀——细胞体积明显增大,此时记录到的电流也被迅速激活,且具有明显外向整流特征。100μmol/L阳性对照药 NPPB[5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸]能够明显抑制该电流,其外向电流抑制率为70.1±2.5％、内向电流抑制率为72.1±3.8％(n=6)。经洗脱可部分恢复,证明该外向整流特性的电流为 ICl.vol;2、受试药5-PBDMA(0.3、1、3、10μmol/L)浓度依赖性地抑制ICl.vol,抑制率为别为9.8±3.2％(n=4)、24.5±6.7％(n=5)、56.0±10.2％(n=5),87.6±12.3％(n=3),IC50为3.55μmol/L。 结论:大鼠源肾小球系膜细胞上存在容积敏感性氯电流 ICl.vol,5-PBDMA对该离子通道电流具有一定的抑制作用,3μmol/L5-PBDMA对 ICl.vol的抑制率为56.0±10.2％(n=5)。 第三部分 5-PBDMA对高糖刺激下系膜细胞的作用及机制研究 目的:探讨5-PBDMA对高糖刺激下增殖的系膜细胞的作用及可能的机制。 方法:培养大鼠肾小球系膜细胞(MC),给予不同浓度的葡萄糖干预 MC增殖,共作用不同时间, MTT法检测细胞增殖结果,确定最佳葡萄糖浓度和造模时间。在此模型基础上分别加入0.3,1,3,10,30μmol/L的5-PBDMA共培养,检测各组给药细胞的增殖情况、使用天狼星红染色法检测胶原相对含量、检测各组细胞 T-SOD、MDA的水平; RT-PCR法检测包括 PPAR-α、PPAR-β、PPAR-γ、TGF-β1、GluT1和IL-6 mRNA等相关因子的表达水平,。 结果:1、高糖刺激能明显促进系膜细胞增殖,但该效应在给与葡萄糖浓度为30.5mM共培养48h时,达到最佳,建立模型。2、在高糖模型培养条件上,加入药物干预。0.3,1,3,10,30μmol/L的5-PBDMA可以剂量依赖性得抑制系膜细胞增殖;3、高糖刺激能明显增加 MC胶原总量,5-PBDMA能降低胶原总量的增加量,且低剂量药物干预组改善作用明显;4、高糖刺激系膜细胞内 T-SOD水平降低, MDA水平升高,5-PBDMA可改善两参数变化,但不呈现浓度依赖性;5)系膜细胞相关细胞因子mRNA表达水平被高糖刺激显著影响:TGF-β1、GluT1、IL-6 mRNA表达上调,PPAR-α、PPAR-β、PPAR-γ mRNA表达下调;5-PBDMA可以改善除 TGF-β1以外的其他细胞因子的异常表达。 结论:5-PBDMA在细胞水平上可明显抑制由高糖诱导的MC增殖、降低胶原总量和MDA水平的增加、改善 T-SOD水平的降低。结合分子生物学的实验结果,提示这些改善作用可能的机制有:对抗氧化应激、抑制肾小球纤维化,抗炎以及上调PPAR-α、PPAR-β、PPAR-γmRNA的表达、下调GluT1、IL-6 mRNA的表达等。