论文部分内容阅读
稻纵卷叶螟 Cnaphalocrocis medinalis(Guenée)是一种重要的水稻害虫，传统的化学防治带来了许多问题，如抗药性、环境污染等。目前基于行为调控的防治，已经成为防治稻纵卷叶螟的重要手段。化学感受蛋白(CSPs)作为运输气味分子和化学刺激物的载体，在昆虫识别信息化学物质的过程中起着重要的作用。然而稻纵卷叶螟化学感受蛋白的具体功能仍不明确，如果能明确CmedCSPs在稻纵卷叶螟嗅觉感受中的功能，则可为开发稻纵卷叶螟引诱剂及驱避剂提供理论依据。为此，本文以稻纵卷叶螟为研究对象，从已有的转录组数据中筛选并克隆了7个CmedCSPs基因，分析了7个CmedCSPs基因的时空表达与其行为的相关性，表达并纯化CmedCSP33，测定了重组CmedCSP33在两种pH值环境下与37种水稻挥发物的结合特性，以期为探明CmedCSPs在稻纵卷叶螟嗅觉感受中的功能奠定基础。主要结果如下： 1．CmedCSPs基因的克隆及序列分析 通过 RT-PCR技术成功克隆了7个 CemdCSPs基因，分别为 CmedCSP14、CmedCSP23、CmedCSP24、CmedCSP25、CmedCSP28、CmedCSP30、CmedCSP33基因（GenBank登录号为：KM365198、KP975086、KP975087、KP975088、KP975091、KP975093、KP975096），开放阅读框分别为327 bp、387 bp、384 bp、384 bp、375 bp、372 bp、363 bp，各编码108、128、127、127、124、123、120个氨基酸，分别有18、18、16、18、18、18、16个氨基酸残基的信号肽。系统进化树分析表明CemdCSPs基因与其他鳞翅目昆虫CSPs基因有较高的同源性。 2．CmedCSPs基因的时空表达谱 通过荧光定量PCR技术对7个CemdCSPs基因的时空表达情况进行了测定。结果表明，在幼虫期和蛹期，大多数CemdCSPs基因的表达量在5龄幼虫达到了较高的水平；在成虫期主要表达于触角、头、足等部位，在胸、翅、脂肪体、表皮、腹末等部位亦有表达。CmedCSPs基因在成虫期的表达量受日龄影响，比如在雄虫触角， CmedCSP14在1 d、CmedCSP33在1 d和3 d的表达量显著高于其他日龄。CmedCSPs基因的表达量在不同性别虫态下有一定的差异性，在不同部位和不同日龄表现的情况不一样。CmedCSPs基因的表达量受到交配情况的影响，比如CmedCSP14在未交配雌雄虫触角中的表达量均显著高于已交配雌雄虫触角。 3．CmedCSP33的原核表达、纯化及荧光结合特性 构建了表达载体pET-22b(+)-CmedCSP33，通过体外原核表达技术成功表达；通过 DE52弱阴离子交换层析柱和 QFF强阴离子交换层析柱系统，纯化获得了重组CmedCSP33的纯蛋白。利用荧光竞争结合试验，分别测定了CmedCSP33与37种水稻挥发物在酸性(pH=5.0)和中性(pH=7.4)环境中的结合特性。结果表明： 在酸性条件下，有29种气味物质与CmedCSP33有较好的结合能力，这些物质包括供试的全部醛酮类、芳香类以及大部分的烷烃类、烯烃类、醇类物质；在中性条件下，有12种气味物质与CmedCSP33有较好的结合能力，这些物质包括供试的部分醛酮类、芳香类、烷烃类、烯烃类和醇类物质。CmedCSP33在酸性环境中与气味物质的结合能力总体强于中性环境，而CmedCSP33在中性环境中与辛烯、2-庚酮的结合能力强于酸性环境。