论文部分内容阅读
棉花是世界上重要的经济作物和纤维作物,其种植范围遍布世界上大多数国家。我国是棉花种植最多的国家之一。棉纤维是纺织业的重要原材料,可以用来制成多种织物,如衣物、棉布等。近年来,外界的极端环境包括干旱、高盐、冷等,严重影响我国棉花的生长,并导致棉花产量和纤维品质下降。因此,如何增强棉花对逆境胁迫的耐受性是科学家一直关注的焦点。脱落酸(Abscisic acid,ABA)是植物体内重要的激素,可以调节植物气孔关闭、抑制种子萌发和主根生长,尤其在抵御外界不良环境方面,发挥核心作用。因此,ABA也被称为抗逆激素。ABA参与植物的生长调控需要一系列的信号转导组分,包括:ABA受体蛋白 PYL(Pyrabatin resistance 1-like)、A 类PP2C(Protein phosphatase 2C)磷酸酶、SnRK2s(SNF 1-related kinase 2)蛋白激酶和效应因子。对棉花PYLs的基因克隆和功能分析,能更清楚地了解棉花中ABA信号的转导过程,为进一步研究棉花抗逆机理和筛选抗逆基因奠定基础。本实验室以拟南芥PYLs蛋白的氨基酸序列为模板,从棉花数据库中比对出了 40个ABA受体基因。本文根据其与拟南芥PYLs的同源性,筛选出与AtPYL8和AtPYL5高度同源的三个GhPYL,分别为GhPYL9-4D、GhPYL9-6A和GhPYL6-1A。拟南芥中,AtPYL8和AtPYL5发挥着重要的功能。超表达AtPYL8和AtPYL5增强了拟南芥对ABA的敏感性和对干旱的耐受性。我们利用生物信息学的手段分析了三者与拟南芥PYLs蛋白二级结构的保守性和进化上的亲缘关系,结合RT-PCR和qRT-PCR的方法研究了这三个棉花PYLs基因的组织定位表达和胁迫诱导下的基因表达。同时利用酵母双杂交的方法分析了它们与GhPP2CA的体外互作情况,并通过构建这三个基因的超表达载体,转化拟南芥获得转基因纯合植株,进一步探究ABA、NaC1和甘露醇对其萌发和根生长的影响。主要结果如下:GhPYL9-4D、GhPYL9-6A和GhPYL6-1A与拟南芥PYLs蛋白具有保守的功能域。GhPYL9-4D、GhPYL9-6A和GhPYL6-1A的组织表达具有特异性。GhPYL9-4D、和GhPYL6-1A在ABA和干旱胁迫下的基因表达模式不尽相同。qRT-PCR结果显示,GhPYL9-4D、GhPYL9-6A和GhPYL6-1A三个基因的表达在ABA处理下降低,但在干旱胁迫下,表达增加。GhPYL9-4D、GhPYL9-6A和GhPYL6-1A与PP2CA蛋白在体外互作,且大部分不依赖ABA的存在。研究了 ABA、NaC1和甘露醇对过表达GGhPYL9-4D、GhPYL9-6A和GhPYL6-1A转基因植株种子萌发和根生长的影响,发现在含有ABA的培养基上,GhPYL9-4D超表达植株的萌发率和绿苗率低于野生型(WT);其主根生长在含ABA培养基上受到显著抑制,说明GhPYL9-4D可促进拟南芥种子萌发和幼苗生长对ABA的敏感性。在含有不同浓度NaC1培养基上,超表达GhPYL9-4D株系种子的萌发率、绿苗率和主根长度与WT无明显差异。在不同浓度甘露醇培养基上,超表达GhPYL9-4D植株与WT相比,种子萌发率没有明显差别,但绿苗率降低,而且甘露醇处理下转基因幼苗主根长度显著比WT长,说明过量表达GhPYL9-4D增强了幼苗生长对甘露醇的耐受性。进一步研究发现,ABA主要通过抑制超表达植株根尖分生区的长度和分生区的细胞数目抑制超表达GhPYL9-4D植株主根生长,外源添加生长素可恢复ABA作用下GhPYL9-4D转基因拟南芥与WT在主根生长方面的差异。与WT相比,超表达GhPYL9-4D降低了甘露醇处理下转基因拟南芥根中的活性氧的水平。而且,超表达GhPYL9-4D促进了甘露醇处理下转基因拟南芥体内抗旱基因的表达。VIGS干涉实验表明,沉默GhPYL9-4D以后,棉花植株表现出对干旱敏感的表型。ABA抑制超表达GhPYL9-6A拟南芥植物种子萌发和主根生长。NaC1胁迫下GhPYL9-6A超表达植株种子萌发和主根生长与WT没有明显差异。甘露醇处理下,GhPYL9-6A超表达植株种子萌发率与WT没有显著差异,但其主根长度明显比WT长。说明过量表达GhPYL9-6A增强了拟南芥对ABA的敏感性以及对渗透胁迫的耐受性。而超表达GhPYL6-1A不仅增强了拟南芥种子萌发和主根生长对ABA的敏感性,同时还增强了其对NaC1和甘露醇的敏感性。亚细胞定位分析显示GhPYL9-4D和GhPYL9-6A定位于细胞膜,GhPYL6-1A定位于细胞膜和细胞核。