蜱是一种吸血性节肢动物，它们侵袭人、哺乳动物、鸟类、爬行类，甚至两栖类，广泛分布于世界各地。蜱的危害不仅是作为动物常见的外寄生虫，更重要的是作为许多人和动物重要疾病的传播媒介。例如，蜱传动物血液原虫病一直是困扰畜牧业发展的重大疾病,据联合国粮农组织（FAO）统计，世界上有80%的牛被蜱侵袭，蜱及蜱传疾病每年可造成巨大的经济损失。近年来，经蜱传播的新出现和再发传染疾病,如人莱姆病、Q热、出血热和森林脑炎等疾病直接危害着人类健康。国内外对蜱的研究，目前主要集中在抗蜱疫苗研究等领域，相对而言，蜱与病原体之间关系的研究还处于起始阶段。由于蜱的重要性在于它的媒介特征，病原微生物在蜱体内的侵入、移行和发育是一个复杂的生物学过程，了解蜱与病原微生物间相互作用的机制具有重要意义。动物抵御微生物的感染是通过体内一系列细胞和体液免疫反应来实现。脊椎动物具有先天性免疫体系和获得性免疫体系，而无脊椎动物只有先天性非特异免疫反应。目前研究发现，蜱的先天免疫系统十分强大，拥有复杂的细胞免疫和体液免疫，抵抗微生物感染。当有微生物攻击时，除了物理屏障外，蜱还能表达各种抗菌蛋白质、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、调理素、抗氧化剂和其他致命的分子,共同构成对病原体入侵的应答。对蜱的抗菌肽、溶菌酶等先天性免疫反应分子的鉴定和功能研究，已取得不少进展。为了更深入了解蜱的先天性免疫反应机制，阐明蜱与病原之间复杂关系，本研究以我国南方的优势蜱种镰形扇头蜱（Rhipicephalushaemaphysaloides）为对象，开展了蜱体先天性免疫相关的蛋白酶抑制分子（丝氨酸蛋白酶抑制分子，Serpin）、调理蛋白（Subolesin）和miRNA分子的分离鉴定和部分功能研究，获得如下研究结果：1.镰形扇头蜱二个丝氨酸蛋白酶抑制分子（Serpin）是具有多重功能的先天性免疫相关分子。利用本实验室已克隆的镰形扇头蜱的二个Serpin分子RHS1/RHS2基因的重组质粒，构建重组表达质粒，完成重组蛋白的表达和纯化，获得重组RHS1（rRHS1）和RHS2（rRHS2）。测定rRHS1和rRHS2对五种丝氨酸酶的抑制活性发现，rRHS1/rRHS2都对胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）显示最强的抑制活性，分别最大抑制了95.6%和94.2%的酶活性，凝血酶（Thrombin）次之，rRHS1最大抑制65.5%的酶活性，但rRHS2可抑制约30%的凝血酶活性。rRHS1/rRHS2对弹性蛋白酶和胰蛋白酶都没有表现出抑制活性，而对十因子（FactorX）仅有较低的抑制活性。应用APTT和PT试验，进行了二个Serpin分子的抗凝血作用研究，结果rRHS1对内源性凝血途径有显著的抑制作用，而rRHS2没有抑制作用。用重组表达的rRHS1/rRHS2蛋白与巨噬细胞RAW26.7共同培养，发现在1-15μg/ml各个浓度梯度RHS1/RHS2蛋白都有抑制细胞增殖活性，且RHS2蛋白对巨噬细胞有更好的抑制作用，表明RHS1/RHS2对哺乳动物细胞具有免疫调节作用。RHS1/RHS2的RNAi研究发现，与荧光素酶（luciferase）对照组相比，RHS1的24小时吸附率和饱血率分别是42.5%和23.34%，，RHS2是35%和11.67%，对照luciferase是71.67%和35.8%，表明RHS1/RHS2在蜱的吸血过程中有重要作用。但在动物免疫保护和抗蜱疫苗实验，实验组与对照组之间没有显著的变化。通过显微注射方法，将田鼠巴贝西原虫、大肠杆菌和LPS（脂多糖）注射进入蜱体，观察不同病原或免疫刺激抗原诱导的蜱Serpin分子的表达变化，探索其参与先天性免疫反应的特点。结果显示，巴贝西原虫组，RHS1只有在注射后5d较对照组有明显的上升，而RHS2在3，5，9d都有明显上升。大肠杆菌组，对蜱体内RHS1在3，7，9d表达量有显著上升,RHS2在3，5，7，9d表达量明显上升。；LPS诱导后只有RHS1在5d与对照组相比有显著升高。这些结果说明，不同病原对二个serpin分子的诱导反应各不相同。2.镰形扇头蜱Subolsin克隆鉴定和初步分析根据已报道的其他蜱种的Subolesin基因的保守区设计引物，扩增镰形扇头蜱中的Subolesin的保守片段。利用得到的Subolesin保守片段序列，通过3’RACE序列和5’RACE方法克隆到镰形扇头蜱Subolesin全长基因序列，命名为RHSub。RHSub的全长基因为1435bp,具有一个编码161个氨基酸的开放阅读框，没有信号肽序列，推测RHSub蛋白的大小为44kDa，将RHSub的ORF亚克隆至PGEX-4T-1表达载体，转化BL21感受态细胞，成功进行重组表达。RNA干扰实验发现，实验组与对照组相比饱血率和饱血时间都有显著的下降，表明RHSub在蜱的吸血过程中有重要的作用。用重组表达的Subolesin蛋白与巨噬细胞RAW264.7共同培养，在15ug/ml,7.5ug/ml浓度有显著的抑制活性。结果提示Subolesin蛋白对巨噬细胞很好的抑制作用。蜱注射病原实验显示，注射Babesia原虫，攻毒后第9天Subolesin的表达量有显著的上升，表明与巴贝斯虫感染的先天性免疫直接相关。3.先天性免疫相关的miRNA分子筛选脂多糖LPS是脂质和多糖的复合物，为革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，LPS能激活节肢动物的先天性免疫途径。本研究通过显微注射方法，分别向镰形扇头蜱雌蜱和雄蜱中注射PBS和LPS，通过检测蜱中的小RNA（sRNA）转录组，比较分析LPS诱导后与先天性免疫有关的miRNA。结果表明：（1）.构建了4个小RNA文库，包括雌蜱LPS注射组，雌蜱PBS注射组以及雄蜱LPS注射组和雄蜱PBS注射组，分别得到1.2千万，1.1千万，1.5千万和1.4千万个18-30nt的基因数据。（2）雌蜱LPS注射组，雌蜱PBS注射组以及雄蜱LPS注射组和雄蜱PBS注射组分别有984，955，1552，955个保守的miRNA家族分子，其中各组最大丰度的3个都是miR-1-3P,miR-1,Let-7-5.(4)。（3）与对照PBS组比较，雌蜱组LPS诱导后有150个miRNA上调，主要有miR-357,miR-4000f-5p,miR-509-3-5p,miR-3422；有160个下调，主要有miR-3807-5p,miR-1287,miR-3152-3p,miR-4669,miR-2397。与对照PBS相比，雄蜱组LPS诱导后有245个miRNA上调，主要有miR-2130,miR-795-5p,miR-4217-3p,miR-4158-5p,miR-3152-3p；有354个下调，主要有miR-4858,miR-2032a,miR-787-3p,miR-93,miR-1321-3p。这些LPS注射后差异表达miRNA作为蜱先天性免疫相关候选分子，可能调控蜱的先天性免疫过程，为进一步研究镰形扇头蜱的先天性免疫miRNA分子提供基础。