中国是全球最大的猪肉生产国和消费国,拥有全球最大的猪肉市场。然而,猪肉市场上一系列食品安全问题制约其健康发展,主要是猪肉的生产、加工及流通等环节中存在致病菌污染问题,常见的致病菌主要包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森菌和大肠杆菌0157等,建立这些致病菌快速检测方法及其生长预测模型对保障我国肉食品安全具有重要意义。本论文以猪肉中致病菌为研究对象,建立了猪肉中五种致病菌多重PCR快速检测方法及猪肉中金黄色葡萄球菌荧光定量PCR(染料法和探针法)快速检测方法,并在此基础上,运用荧光定量PCR方法(染料法)对猪肉中金黄色葡萄球菌生长预测模型进行研究。本论文的研究结果可为猪肉中致病菌的快速检测和风险评估提供科学依据。具体研究内容如下：1.猪肉中五种致病菌多重PCR检测方法的建立。1.1五种致病菌多重PCR检测方法的建立。根据沙门氏菌的侵袭蛋白invA基因、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶nuc基因、单增李斯特菌的内化素hlyA基因、小肠结肠炎耶尔森菌的ail基因和大肠杆菌0157的rfbE基因设计引物,通过对引物特异性试验、扩增效率评价和灵敏度检测等步骤,且16S rRNA基因作为内控基因,建立了沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森菌和大肠杆菌0157这五种致病菌的多重PCR快速检测方法。结果显示,多重PCR检测方法特异性强,结果可靠,且扩增效率高,稳定性好,五种菌株混合检测与单一菌株单独检测其扩增效率没有明显差别。该检测方法灵敏度高,沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌0157检测的灵敏度均为小于10 cfu·mL-1;金黄色葡萄球菌和小肠结肠炎耶尔森菌检测的灵敏度均为10cf·mL-1;该方法同时检测五种菌株(沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森菌和大肠杆菌0157)的灵敏度为103cfu·ML-1。1.2人工污染猪肉中五种致病菌多重PCR检测方法的建立。在第一部分研究结果的基础上,利用最佳的反应条件和反应体系进行多重PCR扩增,16S rRNA基因作为内控基因进行试验。同时,运用传统培养方法验证。结果显示,运用多重PCR方法检测单一菌株(沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森菌和大肠杆菌0157)的最低检测限分别为59、23.3、12、35 cfo·(25g)-1。运用多重PCR方法同时检测五种菌株最低检测限分别为142、51、9、33和670cfu·(25g)-1。因此,与传统培养方法相比,多重PCR检测方法更具有特异、快速、灵敏等优点,适用于猪肉中致病菌的快速检测。1.3市售猪肉中五种致病菌污染状况调查。基于猪肉中五种致病菌多重PCR快速检测方法,2011年6月～2012年5月对南京市猪肉(165份)中五种致病菌的污染情况进行了调查；16S rRNA基因作为内控基因进行试验。结果显示,首先,基于多重PCR方法检测五种致病菌的阳性检出率(27.27%),高于基于传统培养方法检测五种致病菌的阳性检测率(24.8%)。不同致病菌污染率明显不同,金黄色葡萄球菌的检出率居首位(12.7%)。其次,基于传统培养方法检测,准确率达到82%。基于多重PCR检测方法检测,准确率达到90%。农贸市场五种致病菌的检出率(40.0%)显著高于超市五种致病菌的检出率(10.9%)。无论是超市还是农贸市场,金黄色葡萄球菌的检出率均最高,分别为5.5%和16.4%。最后,7-8月份五种致病菌的总检出率(60%以上)显著高于其他月份的检出率。1-3月份和10～12月份检出率全年最低。而且,五种致病菌中金黄色葡萄球菌在不同时间段检出率均较高。因此,本试验基于多重PCR检测方法与传统培养方法相比,灵敏度高、检出率也高。2.猪肉中金黄色葡萄球菌荧光定量PCR检测方法的建立。2.1金黄色葡萄球菌荧光定量PCR方法的建立。通过引物特异性、灵敏度检测(细菌基因组DNA与细菌纯培养物)和标准曲线(细菌基因组DNA与细菌纯培养物)构建,结果显示,金黄色葡萄球菌荧光定量PCR快速方法特异性强。虽然TaqMan探针法的特异性好于SYBR Green染料法,可是SYBR Green染料法的灵敏度(10cfu·mL-1)高于TaqMan探针法(102 cfu·mL-1).细菌纯培养物灵敏度与细菌基因组DNA灵敏度结果一致。基于SYBR Green染料法和TaqMan探针法所构建的标准曲线线性相关性均良好,变异系数较小,重复性好。因此,与TaqMan探针法相比,SYBR Green染料法的Ct值较小,灵敏度较高。细菌纯培养物与基因组DNA所构建的标准曲线结果类似。2.2人工污染猪肉中金黄色葡萄球菌荧光定量PCR方法的建立。对人工污染猪肉样品进行定量检测,确定在实际猪肉样品检测过程中不同荧光定量PCR方法选择。结果表明,建立了猪肉中金黄色葡萄球菌荧光定量PCR方法,且通过细菌基因组DNA标准曲线可对人工污染的猪肉样品进行定量检测。3.荧光定量PCR方法建立猪肉中金黄色葡萄球菌生长预测模型。在上一部分研究结果的基础上,通过人工污染金黄色葡萄球菌至猪肉样品,利用细菌基因组DNA的荧光定量PCR方法建立了猪肉中金黄色葡萄球菌在不同贮藏温度(7、10、15、20、25和30℃)下的三种初级模型(修正Gompertz、Logistic和Richards模型),然后,根据Rathowsky平方根方程建立了二级模型,最后,通过对这两种方法(荧光定量PCR法和传统培养方法)所建立的模型(初级模型和二级模型)相比较来评估荧光定量PCR法所得模型的可靠性。结果表明：利用R2、MSE、Bf值和Af值等相关指标进行评价,三种模型均可对猪肉中金黄色葡萄球菌的生长曲线基于荧光定量PCR法进行拟合。对于猪肉中金黄色葡萄球菌生长描述的最佳模型为修正的Gompertz模型,且通过验证所获得的Bf值和Af值均在可接受的范围之内,证实模型预测的可行性。此外,运用Rathowsky平方根方程建立了二级模型,且模型的拟合效果较好。最大生长速率随着贮藏温度的升高逐渐增加(0.04～0.9 log cfu·(mL·h)-1)且迟滞期也逐渐缩短(33-1h),因而,该方程可评价温度对微生物生长的影响。总之,通过比较两种方法所得到的生长曲线特征和生长参数等指标,结果是运用荧光定量PCR法与传统方法所建立的模型无明显差别,二者都能更好地预测猪肉中金黄色葡萄球菌的生长特性；且荧光定量PCR法克服了基于传统方法所建模型时人力物力浪费与特异性差等不足,为猪肉中金黄色葡萄球菌的生长预测和风险评估提供科学依据。结论：(1)基于猪肉中主要致病菌多重PCR快速检测方法同时检测五种菌株(沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森菌和大肠杆菌0157)的最低检测限分别为142、51、9、33和670 cfu·(25g)-1。与传统培养计数法相比,检测时间短、特异性强,灵敏度高,适合猪肉中以上五种致病菌的快速检测。(2)猪肉中金黄色葡萄球菌荧光定量PCR快速定量检测方法特异性强、灵敏度高,且染料法的灵敏度高于探针法,适用猪肉中金黄色葡萄球菌快速定量检测。(3)运用荧光定量PCR方法(染料法)建立的猪肉中金黄色葡萄球菌在不同贮藏温度下的三种初级生长模型(修正Gompertz、Logistic和Richards模型)均可对猪肉中金黄色葡萄球菌的生长曲线进行拟合。运用Rathowsky平方根方程建立的二级模型,拟合度较好,可用于评价温度对微生物生长的影响。荧光定量PCR方法与传统方法所建模型无明显差别；且荧光定量PCR方法克服了传统模型耗时耗力、特异性差等问题,为猪肉中金黄色葡萄球菌的安全性评估提供技术支持。