论文部分内容阅读
急性肺损伤／急性呼吸窘迫综合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome, ALI/ARDS)是多种病因引起的以进行性呼吸困难、低氧血症、呼吸膜及血管内皮损伤为特征的临床急危重症。研究表明早期的急性炎症瀑布反应及其继发的肺纤维化(pulmonary fibrosis, PF)是构成ALI患者死亡的重要因素。因而针对ALI的炎症失控及其继发的肺纤维化采取“双控调节”治疗模式,可能成为降低ALI死亡率的有效策略。炎症小体(inflammasome)在炎症研究领域备受关注,其活化后可促进标志性促炎因子IL-1p、IL-18和高迁移率族蛋白B1的成熟与分泌。近年来,炎症小体所介导的炎症反应在ALI中的作用引起学者的关注,ALI时肺内炎症小体活化后的标志性促炎因子IL-1p和IL-18表达显著增加,提示ALI早期的“炎症失控”可能与炎症小体的表达上调和活化有关。ALI患者度过急性炎症期后可继发肺纤维化。ALI急性期伴随大量炎症因子和促纤维化因子的合成与分泌,诱导肺内成纤维细胞分化成熟为肌成纤维细胞,后者为肺纤维化的主要效应细胞。此外肺内上皮细胞(如肺泡Ⅱ型上皮细胞和气道上皮细胞等)可通过上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)增加肺内肌成纤维细胞的数量。因此,寻找具有抗炎特性、调控成纤维细胞分化成熟和EMT的内外源性保护因子可为ALI时继发肺纤维化的治疗提供新思路。ALI时肺内脂质代谢非常活跃,其中花生四烯酸(arachidonic acid,AA)可经细胞色素P450(cytochromes P450, CYP)表氧化酶作用生成环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids, EETs),后者主要被可溶性环氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase, sEH)水解为活性极低的代谢产物DHET。EETs是细菌感染时肺内主要的类花生酸,具有降压、减少心肌和脑组织的梗死面积和减轻吸烟引起的肺内炎症反应等效应。但EETs对ALI是否具有保护作用,以及是否通过影响ALI时肺内炎症小体的活化而调控肺内的炎症反应尚未见报道。Zhao等人报道EETs可抑制TGF-β1诱导的肾上皮细胞α-SMA的表达,上调E-钙粘素的表达,提示EETs可能抑制TGF-β1诱导的EMT。目的：本研究拟探讨AA-CYP-EETs代谢通路的重要活性物质EETs在ALI及其继发肺纤维化中的作用,并初步探讨其机制。方法：1. EETs对ALI小鼠肺内炎症的影响及其机制探讨采用连续3天腹腔注射低剂量LPS(5mg/kg)复制小鼠ALI模型,腹腔注射特异性可溶性环氧化物水解酶抑制剂(TPPU,1mg/kg/day)抑制小鼠体内EETs的降解、增加体内EETs含量,探讨EETs对ALI的作用。观察小鼠的一般情况；HE染色观察小鼠肺组织病理形态学改变；BCA法测定小鼠BALF中总蛋白含量；采用相应试剂盒分别检测BALF中LDH活性和肺组织中MPO活性；采用RT-PCR法检测主要炎症小体蛋白NLRP3和NLRC4mRNA的表达；ELISA法检测小鼠BLAF中炎症小体活化的标志细胞因子IL-1p的含量；RT-PCR法检测小鼠肺内炎症标志因子TNF-α mRNA的含量。以小鼠巨噬细胞为研究对象,观察TPPU(1μM、10μM)对LPS(10μg/mL)应激下小鼠巨噬细胞IL-1p的合成与分泌的影响,检测细胞培养上清液中LDH活性。2. EETs对ALI继发肺纤维化的影响及其机制探讨复制小鼠ALI模型,并运用TPPU抑制EETs的降解；Masson染色观察小鼠肺组织中胶原沉积；检测肺组织中脯氨酸含量；采用RT-PCR法检测小鼠肺内TGF-β1、α-SMA和Ⅲ型胶原mRNA的表达；采用ELISA法检测小鼠BALF和血清中TGF-β1的含量。以小鼠成纤维细胞为研究对象,采用TGF-β1(5ng/mL)诱导其分化为肺纤维化的主要效应细胞肌成纤维细胞,应用TPPU抑制(?) EETs的降解,观察EETs对成纤维细胞分化成熟的影响。RT-PCR法检测肌成纤维细胞的标志分子α-SMA的(?)nRNA含量,消化法检测细胞培养上清液中羟脯氨酸的含量。以人肺泡Ⅱ型上皮细胞为研究对象,采用TGF-β1(5ng/mL)诱导其发生EMT,并应用TPPU观察EETs对肺泡Ⅱ型上皮细胞EMT的影响。倒置显微镜观察细胞形态学改变,RT-PCR法检测上皮标志分子E-钙粘素mRNA含量,消化法检测细胞培养上清液中羟脯氨酸的含量。3. EETs对支气管上皮细胞损伤修复的影响构建人重组CYP2J2过表达质粒,通过双酶切法和DNA测序验证插入序列的正确性。将人重组CYP2J2过表达质粒转染至人支气管上皮细胞(HBECs)中,通过荧光显微镜观察、RT-PCR法检测其转染效率和效果。结合TPPU的运用,采用MTT法和流式细胞术检测EETs对HBECs细胞增殖的影响,PI染色检测细胞晚期凋亡,最后采用划痕实验观察EETs对支气管上皮损伤修复的影响。结果：1. EETs对ALI小鼠肺内炎症的影响及其机制探讨(1)与正常组小鼠比较,ALI组小鼠体重降低,肺内大量炎症细胞浸润、水肿、肺泡隔增厚以及肺泡塌陷。TPPU处理可减轻上述改变。(2)与正常组相比,ALI组小鼠BALF中总蛋白含量和中性粒细胞数较正常组显著增高(P<0.01)；TPPU处理可降低总蛋白含量和中性粒细胞数,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)与正常组相比,ALI组小鼠血清和BALF中LDH活性显著升高,TPPU处理可显著降低其活性,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4) RT-PCR结果显示,LPS诱导的ALI小鼠肺内主要炎症小体蛋白NLRP3mRNA和NLRC4mRNA水平较正常组显著升高(P<0.05)。(5) RT-PCR和ELISA检测结果显示,ALI小鼠肺内IL-1p的mRNA表达水平和蛋白含量较正常组均显著升高,TPPU处理可显著性抑制IL-1p的mRNA表达和蛋白含量,差异具有统计学意义(P<0.05)。(6)RT-PCR结果显示ALI组(0.28±0.03)小鼠肺内TNF-α mRNA水平较正常组(0.60±0.09)显著升高(P<0.05),TPPU处理可抑制ALI小鼠肺内TNF-α mRNA的表达(0.45±0.05,P<0.05)。(7)LPS应激可刺激小鼠巨噬细胞IL-1p蛋白的分泌,TPPU处理可降低LPS应激的小鼠巨噬细胞培养上清液中IL-1β的含量,差异具统计学意义(P<0.05)。(8)LPS应激可增加小鼠巨噬细胞培养上清液中LDH活性,TPPU处理可显著降低LDH的活性,差异具有统计学意义(P<0.05)。2. EETs对ALI继发肺纤维化的影响及其机制探讨(1) Masson染色结果显示,小鼠21天时肺内大量胶原沉积,表明ALI/PF动物模型复制成功。而TPPU处理可增加小鼠体重,减轻ALI组小鼠肺内病理改变,减少胶原沉积。(2)正常组小鼠肺内羟脯氨酸含量为0.47±0.06μg/g组织,ALI组小鼠肺内羟脯氨酸含量显著增加(0.85±0.09μg/g组织),而TPPU处理可降低肺内羟脯氨酸含量(0.63±0.09gg/g组织),差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)RT-PCR结果表明：与正常组相比,ALI组小鼠肺内a-SMA、 TGF-β1和Ⅲ型胶原mRNA表达显著增加,TPPU处理可降低三者在ALI小鼠肺内的表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)与正常组相比,ALI组小鼠血清和BALF中TGF-β1含量显著高。TPPU处理可降低其活性,差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)TGF-β1(5ng/mL)可显著增加小鼠成纤维细胞α-SMA mRNA的表达和培养上清液羟脯氨酸的含量,TPPU预处理可明显抑制α-SMA mRNA的表达,以及降低培养上清液中羟脯氨酸的含量,差异具有统计学意义(P<0.05)。(6) TGF-β1诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞24h后,可见细胞变长并向两端伸展,呈现成纤维细胞样改变；48h后改变更为明显,TPPU预处理可显著抑制上述形态改变。(7)与正常组相比,TGF-β1可显著性降低肺泡Ⅱ型上皮细胞E-钙粘素mRNA的表达,增加培养上清液中羟脯氨酸的含量(P<0.05),TPPU预处理可明显地促进E-钙粘素mRNA的表达、降低培养上清液中羟脯氨酸的含量(P<0.05)。3. EETs对支气管上皮细胞损伤修复的影响(1)成功构建人重组CYP2J2过表达质粒并转染至HBECs中,通过倒置荧光显微镜观察,转染率为40%-60%。RT-PCR结果显示,与转染空质粒组相比,转染人重组CYP2J2过表达质粒可显著增加细胞内CYP2J2mRNA的表达(P<0.05)。(2)MTT结果显示,CYP2J2过表达可促进HBECs细胞增殖；流式细胞术结果表明,TPPU预处理可增加HBECs的G2/G1比值。(3)流式细胞术和PI染色结果表明LPS可诱导HBECs细胞凋亡(P<0.05),而TPPU预处理可显著性抑制其凋亡(P<0.05)。(4)划痕实验证实,采用TPPU抑制HBECs的EETs的降解,增大修复指数(P<0.01),可促进HBECs的损伤修复。结论：(1)EETs减轻LPS诱导小鼠ALI的肺内炎症反应,其机制可能与抑制炎症小体的活化有关。(2)EETs可减轻ALI继发的肺纤维化,其机制与抑制肺内成纤维细胞的分化成熟和肺泡上皮细胞的EMT有关。(3)EETs可促进人支气管上皮细胞增殖、抑制LPS诱导的细胞凋亡,促进气道上皮的损伤修复。