骨科临床工作中经常遇到关节软骨的损伤,甚至是软骨的缺损,其原因最常见为创伤,其他原因如感染、自身免疫、肿瘤等因素也可以引起各种关节表面疾患从而造成软骨损伤。因此软骨疾病是骨关节科临床医生最常面对的疾病之一,也是极为困难的课题之一。关节软骨是由软骨细胞、胶原和蛋白多糖的基质组成,无血管、淋巴管及神经支配。关节软骨缺乏血管、软骨细胞不能迁移、成熟软骨细胞不能增值等都限制了修复反应,所以其自身修复能力极为有限。关节软骨损伤甚至缺损后,将影响关节的正常滑动,引起疼痛、不稳和关节功能障碍,加速关节的退变,导致骨关节炎的发生,严重的软骨损伤远期可导致关节疼痛,畸形等。负重关节如膝关节在关节炎晚期通常只能进行人工关节置换术。能否在关节软骨损伤的早期修复软骨损伤?从而逆转软骨损伤,逆转关节退变。因此软骨损伤后的修复一直是创伤骨科和骨关节科的研究热点。临床上常用的钻孔微骨折、关节镜下刨削等治疗方法虽能解决部分问题,但疗效仍不十分满意；自体软骨组织移植是一种疗效较为满意的方法,但患者要在多承受一次手术创伤的同时还要牺牲一部分自体正常软骨。上世纪80年代Robert Langer和Joseph P Vacanti首次提出”组织工程学”,为软骨修复带来了新的希望。组织工程学在软骨修复上的应用的核心是利用少量种子细胞经体外培养扩增,然后将扩增后的活性细胞附着于特定的支架材料上,再移植到软骨损伤区域而形成新的、健康的软骨组织。组织工程学被认为是最有可能解决软骨损伤修复这一世界性难题的方法之一。种子细胞是组织工程的关键,所以软骨组织工程修复的种子细胞的选择非常重要。采用自身软骨细胞作为种子细胞修复软骨损伤的方法临床效果较好,但是其缺点亦非常明显,那就是要使用正常软骨组织,取材困难、有限,且增加额外的损伤。因此,寻找更为合适的种子细胞就成了问题的关键。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)最早是在骨髓中发现的,随着研究的深入相继从脐血、胎盘、肌肉、血管、脂肪、皮肤等组织中提取出MSCs。间充质干细胞是一种多能干细胞,为中胚层发育的早期细胞,具有多向分化的潜能。在一定条件诱导下,可分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经细胞等,是组织工程理想的种子细胞。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymstem cells, BMSCs)是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞,可在适宜的条件下分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等,是组织工程理想的种子细胞,也是目前研究最广的种子细胞。骨髓来源的间充质干细胞可以定向分化为软骨细胞,修复软骨缺损。但是骨髓间充质干细胞由于取材、安全性、伦理等问题限制了其应用,而且BMSCs具有含量极少且分离成功率低等缺点。人脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood-mesenchymal stem cells, hUCB-MSCs)是一类与骨髓间充质干细胞相似的具有多向分化潜能的原始细胞,具有很强的定向分化和增殖能力。脐血间充质干细胞具有以下优点：获取的侵袭性小；干细胞更原始,有更强的增殖分化能力；免疫原性弱；安全性较高；干细胞易于分离。目前脐血间充质干细胞已成为国内外研究的热点。本研究中联合应用密度梯度离心法和细胞贴壁法进行分离、纯化细胞并传代,证实培养细胞为BMSCs和hUCB-MSCs。骨形态发生蛋白(human bone morphogenetic protein, BMP)自上世纪六十年代被发现以来,一直是各国学者研究的热点。骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein-2, BMP-2)是BMP的亚型,在有利于软骨细胞生长的环境下,可诱导间充质干细胞向软骨细胞分化、增殖,并可维持软骨细胞表型。由于BMP局部扩散能力强,单独植入局部容易被组织液冲洗掉或被酶类降解,使其不能充分发挥生物学作用。这就需要一种能持久释放BMP蛋白,维持蛋白浓度的技术来解决这个问题。所以BMP-2基因载入成为新的研究方向。本研究中使用脂质体介导重组质粒pIRES2-EGFP-hBMP-2基因转染人脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞,探讨能否有效转染并促进BMSCs和]hUCB-MSCs在体外向软骨细胞分化。目的探讨脂质体介导重组质粒pIRES2-EGFP-hBMP-2基因转染人脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞并促进其向软骨细胞转化的可行性。方法1.脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的采集、分离、培养、鉴定选择青岛市海慈医疗集团产科3名30岁以下健康、无急慢性疾病、无传染病、血传检测阴性的剖宫产妇采集脐血。新生儿产出后立即在距胎盘处钳夹结扎脐带并切断,行脐带静脉穿刺直接将脐血引流入装有枸橼酸钠的一次性采血袋内,共约30mL。志愿者5人,均为男性,年龄24～36岁。因下肢骨折内固定术后需行内固定物取出术收住青岛市海慈医疗集团创伤骨科。腰硬联合麻醉结束后,内固定取出手术前,用骨穿针在髂前上嵴穿刺抽取5ml骨髓。使用密度梯度离心法和细胞贴壁联合培养方法,分离间充质干细胞,纯化、培养、传代。镜下观察,细胞纯化后,用流式细胞仪检测间充质干细胞表面抗原。细胞高表达CD90, CD105, CD29,不表达造血干细胞表面标记CD34,CD45,确定所培养细胞为间充质干细胞。2.重组质粒pIRES2-EGFP-hBMP-2转染脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞选取P3细胞作为转染细胞。加0.25%胰酶消化,1000r/min离心5min,加入含胎牛血清及青、链霉素双抗的培养液进行单细胞重悬,按照1×106/ml的细胞数接种到灭菌的六孔板内,每孔加入1ml重悬液,加含10%FBS的DMEM/F12培养液至3ml,置于培养箱中培养。将已构建好的重组质粒pIRES2-EGFP-hBMP-2和X-treme GENE转染试剂解冻后,重组质粒1000r/min离心5min。用无血清培养液稀释达到1μg质粒DNA/100ul培养液,混匀。取含有1μgDNA/100ul的稀释液200ul,加入到1,2,3,4个无菌EP管内。分别取6ulX-treme GENE加到上述前4个管中。混匀孵育20min。观察P3细胞融合度达80%以上时可进行转染。加入不含FBS的DMEM/F12培养液1m1。2h后将混匀的DNA复合体分别加入孔中,加无血清培养液至2ml,继续培养。8h后取出细胞,换含10%FBS的DMEM/F12培养液。每24h荧光显微镜下观察一次,观察培养间充质干细胞中增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)的表达情况。荧光采用488nm波长紫外光激发。计算48h时的细胞转染率。收集转染后第3天间充质干细胞及对照组细胞,提取细胞总RNA。使用PrimeScript RT-PCR Kit (TaKaRa公司)试剂盒反转录RNA为cDNA。通过PCR扩增。PCR反应结束后,产物行琼脂糖凝胶电泳,电泳结束后用凝胶成像分析仪成像。取转染后14天间充质干细胞及对照组细胞,按照每孔15×104的细胞数进行细胞爬片,固定,加入0.5%TritonX-100,温育。加入封闭血清,温育。先后加入1：50稀释浓度兔抗人Ⅱ型胶原蛋白一抗、鼠抗兔二抗,温育。加入DAB显色。苏木素复染。树胶封片,显微镜下观察。结果1.从人脐血及骨髓中分离出间充质干细胞,经密度梯度离心法与贴壁培养法结合分离、培养、传代、纯化、鉴定,经形态学观察、流式细胞仪检测予以证实。两种细胞生长略有不同。2.使用重组质粒pIRES2-EGFP-hBMP-2转染脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞。RT-PCR检测予以证实。通过EGFP计算转染率分别为27.7%±7.59%和18.4%±5.94%,hUCB-MSCs的转染率高于BMSCs。免疫组化检测显示两种细胞Ⅱ型胶原蛋白均表达阳性。结论1.本研究成功的分离出脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞,经培养、传代、纯化、鉴定证实为间充质干细胞,并将其诱导为具有向软骨细胞分化潜能的干细胞。2.重组质粒pIRES2-EGFP-hBMP-2基因可以有效转染人脐血和骨髓间充质干细胞,目的基因可促进细胞向软骨细胞转化。创新性1.目前无论是人BMSCs还是hUCB-MSCs,在BMP-2基因转染方面研究较少,特别是hUCB-MSCs。本研究成功应用重组质粒pIRES2-EGFP-hBMP-2有效转染入人脐血和骨髓间充质干细胞,并通过检测证实。2.本研究证实重组质粒pIRES2-EGFP-hBMP-2可以促进BMSCs以及hUCB-MSCs向软骨细胞转化。以期望本结果能为组织工程提供种子细胞,从而修复软骨损伤。