第一部分Copanlisib靶向PI3K/AKT信号对膀胱癌细胞生物学行为的影响【目的】磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）信号通路是人类癌症中最常发生异常改变的通路之一,与肿瘤的发生、发展密切相关。本部分探讨PI3K信号通路及其补充通路的活化与膀胱癌患者的预后关系,以及小分子靶向药物Copanlisib对膀胱癌细胞生物学行为的影响。【方法】运用数据库（https://www.cbioportal.org/）分析PI3K信号通路相关分子基因在肌层浸润性膀胱癌（Muscle invasive bladder cance,MIBC）患者中的突变频率及突变类型。采用数据库（https://www.proteinatlas.org/）比较分析人正常膀胱组织及膀胱癌组织中磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化α亚基（Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunitα,PIK3CA）表达水平的差异。运用数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/）分析PI3K信号通路及其补充信号通路（例如KRAS/RAf信号）相关分子的表达水平与肌层浸润性膀胱癌患者（Muscle invasive bladder cancer patients,MIBCs）的预后关系。另外,通过Western-blot法检测人源性膀胱癌细胞系（T24、5637）以及鼠源性膀胱癌细胞系[UPPL-1541（下文简称UPPL）、BBN963]中AKT信号的表达水平。采用MTS法,以不同药物浓度、不同作用时间,观察Copanlisib对膀胱癌细胞增殖的影响。通过克隆形成实验、迁移实验,观察Copanlisib对T24、UPPL细胞系增殖及迁移的影响。Western-blot检测copanlisib对膀胱癌细胞AKT信号活化影响。【结果】PI3K信号通路相关基因在MIBC中存在广泛的突变。PIK3CA是膀胱癌最常见的突变基因之一,约占MIBC患者的26%。其最常见的突变是错义突变,其次是扩增。基因扩增及拷贝数增加往往引起PIK3CA mRNA高表达。抑癌基因PTEN突变约占MIBC患者的9%,其最常见的突变是缺失性突变,缺失性突变引起PTEN mRNA表达降低。PIK3CA在正常膀胱组织中低表达,在膀胱癌组织中表达增多。通过生存分析发现,尽管PIK3CA高表达并不显著降低MIBC患者的总体生存期（Overall survival,OS）（p=0.076＞0.05）,但是能显著降低MIBC患者的无病生存期（Disease free survival,DFS）（p=0.011＜0.05）。同样AKT丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1基因（AKT serine/threonine kinase 1,AKT1）、雷帕霉素靶蛋白基因（Mechanistic target of rapamycin kinase,MTOR）、真核翻译起始因子4E结合蛋白1基因（Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1,EIF-4EBP1）、核糖体蛋白S6激酶β1基因（Ribosomal protein S6 kinase B1,RPS6KB1）等PI3K信号通路相关基因的高表达与MIBC患者无病生存期（DFS）降低相关。另外PI3K补充通路相关基因KRAS、丝裂原活化蛋白激酶1基因（Mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1）等的高表达,同样显著减低MIBC患者的OS或DFS。Western-blot结果显示,未做特殊处理情况下,T24、UPPL细胞系中p-AKT/AKT信号维持较高水平。随着Copanlisib浓度的升高,膀胱癌细胞活力显著下降。Copanlisib能显著抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移。Copanlisib能显著阻滞p-AKT/AKT信号的活化。【结论】1.PI3K信号通路相关基因在MIBC中存在广泛的突变,该通路相关基因的高表达可能与膀胱癌患者预后不良密切相关。2.相对于正常膀胱组织,PI3KCA在膀胱癌组织中高表达。因此,靶向PI3K/AKT信号通路是治疗膀胱癌的潜在策略。第二部分Copanlisib联合抗PD-1治疗对膀胱癌生长的影响及机制研究【目的】PI3K信号的异常活化不仅影响肿瘤细胞本身,同样通过调节肿瘤微环境中免疫细胞、细胞因子、细胞外基质、免疫检测位点等来形成肿瘤免疫抑制微环境。本部分通过泛-PI3K抑制剂Copanlisib联合抗-程序性死亡蛋白1（Programmed cell death protein 1,PD-1）治疗,探究联合治疗是否能调节肿瘤微环境,增强抗肿瘤免疫,抑制膀胱癌的生长。【方法】将鼠源性BC细胞系UPPL进行免疫正常小鼠双侧皮下移植,待成瘤后随机分为Control组、Copanlisib组、anti-PD-1组、Copanlisib+anti-PD-1（联合治疗组）,分别予以相应的治疗。在第14天时,从各组小鼠中随机处死部分小鼠,收取肿瘤标本分别命名为Sctrl组、Scopan组、SPD1组、Scombo组（“S”代表敏感组）。剩余的小鼠继续治疗喂养,当到达终点时,处死剩余各组小鼠,收取标本,此时肿瘤标本分别命名为Rctrl组、Rcopan组、RPD1组、Rcombo组（“R”代表耐药组）。测量并记录小鼠肿瘤大小、生存时间、体重等参数。对小鼠肿瘤组织以及肿瘤回流淋巴结中细胞进行CD4、CD8、CD25、CD45、FOXP3、CD103、CD11c、CD80、CD86等细胞分子标志物进行染色,并进行流式细胞仪检测。免疫组织化学对肿瘤组织进行CD8分子进行染色。逆转录-实时定量聚合酶链反应（Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测Ⅰ型干扰素（TypeⅠinterferon）（IFN-α1、IFN-α2、IFN-β1）、促炎症细胞因子[白介素-2（Interleukin 2,IL-2）、IL-12)]、抑制炎症细胞因子（IL-6、IL-10）、干扰素-γ（Interferon,IFN-γ）、颗粒酶B（Granzyme B,GZMB）的mRNA水平表达变化。Western-blot用于检测AKT信号的活化。mRNA测序技术对各组肿瘤组织标本进行测序,运用生物信息学方法进行分析,并进行RT-qPCR等验证。【结果】肿瘤生长曲线显示,Copanlisib联合抗PD-1治疗能显著抑制BC的生长。流式细胞仪检测显示,联合治疗增加CD8+T细胞在肿瘤组织中比例,减少调节性T细胞（Regulatory T cell,Tregs）的募集。免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）染色证实,联合治疗促进了CD8+T细胞在肿瘤组织中的浸润。另外,联合治疗促进了肿瘤组织来源的CD103+树突状细胞（Dendritic cells,DCs）在肿瘤回流淋巴结中比例的升高,以及促进了DCs共刺激分子CD80的表达。联合治疗促进了促炎症细胞因子Ⅰ型干扰素、IFN-γ、IL-12的表达,减少抗炎症细胞因子IL-10的表达。mRNA测序结果及生物信息学分析发现,Copanlisib阻滞PI3K信号通路,进一步引起转化生长因子-β受体1（Transforming growth factor beta receptor1,TGFBR1）、转化生长因子-β受体2（TGFBR2）、骨形态发生蛋白受体-1a（Bone morphogenetic protein receptor type 1a,BMPR1a）、骨形态发生蛋白受体-2（BMPR2）等转化生长因子-β（Transforming growth factorβ,TGF-β）受体及下游信号分子的下调,并通过RT-qPCR得到证实。提示,Copanlisib可能通过下调TGF-β受体信号,从而间接调控肿瘤免疫。通过对比分析敏感S组和耐药R组基因表达谱,m TOR信号通路的在Rcombo组中活化。进一步分析发现,脂质运载蛋白2基因（Lipocalin-2,Lcn2）及其相关基因S100钙结合蛋白a9基因（S100calcium binding protein a9,S100a9）、S100a8,基质金属蛋白酶7基因（Matrix metallopeptidase 7,Mmp7）,小富含脯氨酸蛋白家族基因（Small proline-rich protein family,Sprr）在Rcombo组中高表达,且这些分子的高表达与MIBC患者的预后呈负相关。【结论】Copanlisib联合抗PD-1能调节抗肿瘤免疫,促进肿瘤组织中CD8+T细胞的浸润,减少Tregs的招募,促进DCs的活化,并调控一些系列细胞因子的表达;Copanlisib靶向阻滞PI3K/AKT信号,可能通过下调TGF-β受体信号来间接调控肿瘤免疫;另外,Lcn2、Sprr家族基因可能等在晚期膀胱癌耐药及进展中发挥重要作用。第三部分新型自递送纳米药物12ONPs靶向阻滞自噬在治疗膀胱癌中的研究【目的】化学修饰改造自噬阻滞剂Lys05,使其单体聚集形成纳米球微粒12ONPs。前期研究结果显示,12ONPs及其类似物在小鼠体内的抗肿瘤增殖活性是羟基氯喹的30倍。本部分进一步探讨,12ONPs对膀胱癌的影响及可能的机制。【方法】合成并鉴定12ONPs:化学修饰Lys05,形成BAQ12O单体。再经过甲醇溶解、混、蒸馏等步骤后形成12ONPs,利用粒径检测仪、透射电镜观察纳米颗粒的粒径大小、分布及形态。利用MTS法检测12ONPs对膀胱癌细胞的影响:以不同药物浓度、不同作用时间观察12ONPs对膀胱癌细胞增殖的影响。采用透射电镜、Western-blot检测12ONPs对BC自噬的影响。胎盘兰染色观察12ONPs对BC活性的影响,并用Western-blot检测其死亡相关分子的表达。运用酶联免疫吸附实验（ELISA）、化学发光法、RT-qPCR等观察12ONPs对基础损伤相关分子模式（Constitutive damage associated molecular patterns DAMPs,c DAMPs）[例如,高迁移率族蛋白B1（High mobility group box 1,HMGB1）、三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）]及诱导损伤相关分子模式（Inducible DAMPs,i DAMPs）（例如IL-1b）的影响。采用条件培养树突状细胞,并通过流式细胞仪技术、RT-qPCR等检测树突状细胞中CD103+细胞比例、Ⅰ型干扰素等细胞因子的变化。采用免疫正常小鼠BC细胞系皮下移植模型,观察12ONPs对BC生长的影响。测量记录小鼠皮下肿瘤的大小、体重、生存时间等;活体成像观察12ONPs在组织器官中的分布。采用透射电镜、Western-blot检测12ONPs对肿瘤组织自噬的影响。采用免疫组织化学观察12ONPs对肿瘤免疫细胞的影响。【结果】电子显微镜及粒径测量仪结果显示,合成的12ONPs粒径大小大约在150 nm左右,电子显微镜下可见球形的12ONPs纳米颗粒。12ONPs显著抑制膀胱癌细胞的增殖,抑制BC细胞自噬功能,促进肿瘤细胞坏死,同时促进DAMPs（ATP、HMGB1、IL-1等）的合成与释放。12ONPs对BC的治疗,促进了CD103+树突状细胞的比例,增加共刺激分子CD80、CD86的表达,促进Ⅰ型干扰素等细胞因子的表达。12ONPs能高效富集小鼠肿瘤组织,并阻滞BC自噬功能,促进CD8+T细胞的浸润,减少调节性T细胞的聚集,抑制BC的生长。【结论】化学修饰Lys05形成新型自递送纳米药物12ONPs,能高效富集肿瘤组织,通过阻滞自噬诱导BC细胞坏死;坏死过程中的BC细胞释放DAMPs等因子激活DCs,促进肿瘤相关抗原的提呈,增强抗肿瘤免疫,抑制BC的生长。