乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一种严重危害人体健康的常见疾病,呈世界流行趋势。据世界卫生组织报道,全球约20亿人曾感染过HBV,其中3.5亿人为慢性HBV感染者,每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。慢性乙型肝炎是肝硬化和肝癌的危险因素。缺少十分有效的清除病毒手段一直是困扰慢性乙肝治疗的难题。HBV感染的致病机制复杂,现一般认为是一系列宿主免疫反应造成肝细胞内的病理性免疫损害,引起各种临床表现。而其中主要的免疫效应细胞则是HBV抗原特异性T细胞特别是细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL), HBV特异性CTL对清除肝细胞内感染的HBV起着关键作用。在急性乙型肝炎患者体内,HBV很快能被清除的重要原因是因为存在较强的多克隆CTL反应,而慢性乙型肝炎患者体内CTL反应很弱或针对的病毒抗原表位单一,导致不能完全清除HBV。引起这种HBV特异性CTL反应差异的分子机制目前尚未完全阐明。CTL是CD8+T细胞,其特异性由T细胞受体(T cell receptor, TCR)决定,参与特异性细胞免疫应答的CD8T细胞主要是TCR αβT细胞,其多样性和特异性产生于TCR分子α和p链基因的VDJ重排。因此,揭示特异性CTL的TCR分子的组成特点对深入理解HBV免疫应答反应机制十分重要。本研究的目标是通过获取HBV抗原特异性CTL,分析CTL上的TCR分子特性,转基因表达特异性CTL TCR,使非特异性T淋巴细胞转变为HBV抗原特异性CTL,获得抗病毒活性,从而有助于深入阐明HBV免疫应答反应机制,并将为进一步在机体水平(例如HBV/HLA-A2转基因小鼠体内)评价HBV特异性CTL的作用和机制建立基础,最终为临床发展和完善以HBV抗原特异性CTL为基础的免疫疗法治疗慢性乙肝提供重要帮助。目的：克隆HBV抗原特异性CTL TCR编码基因,通过逆转录病毒介导HBV抗原特异性CTL的TCR转基因表达,初步观察其结合活性。方法：1.采集具有特异性CTL反应的HLA-A2限制性急性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMC),通过体外表位(WLSLLVPFV, Env335-343)多肽和细胞因子的诱导富集特异性CTL后,用流式细胞仪分选法(CD3+CD8+Pentamer+)纯化特异性CTL；对纯化的CTL进行克隆化培养,用抗CD3/CD28抗体在加入经照射的EBV转化B细胞滋养体系中扩增CTL。2.提取扩增后CTL的细胞RNA；设计简并引物进行RT-PCR并结合5’末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)、3’RACE等方法扩增获取编码特异性TCR的α和β链基因；分析一定数量的克隆序列,确定具有优势亚型的α和β链基因作为研究的目标基因。3.构建TCR编码基因重组逆转录病毒载体,用内部核糖体进入位点(IRES)连接α和β链基因；转染包装细胞,获取重组假病毒；对重组假病毒进行鉴定。4.用重组假病毒分别转导Jurkat T细胞和人HLA-A2+的PBMC,针对PBMC,用IL-2和抗CD3抗体刺激细胞分裂增殖以提高转导效率；用Pentamer、抗CD8、抗CD3和抗Vp13荧光抗体(anti-Vβ13TCR-PE)染色,流式细胞仪分析鉴定细胞表面特异性TCR表达水平。结果：1.对6例急性乙肝患者样本600多个TCRα链和β链克隆基因序列分析的结果提示,HBV特异性CTL均呈现TCR分子α链、β链基因家族优势表达特点,每例患者样本以2-4种α链和1～4种β链家族为主,其中α2、α14、α15、β3、β13和p23家族同时出现在1例以上患者,有1例患者所有克隆分析的β链基因均为β13家族。同一患者同一家族α、β链CDR3区序列趋于一致,而不同患者同一家族α、p链CDR3区序列相差较大。2.从1例HLA-A2+急性乙肝患者样本中分别获得了2组TCR Vα、Vp配对全长基因序列,分别命名为α21β13、α15β13。3.经过鉴定,TCR编码基因α15β13、α21β13已分别连入特异性逆转录病毒SAMEN载体,分别构建成重组逆转录病毒载体SAMEN-α15-β13和SAMEN-α21-β13。将其转染包装细胞后获得的包装重组病毒达到1.5×105～5.0×105IU/ml,4.用针对目标TCR的特异性抗Vp链抗体anti-Vβ13TCR-PE和HLA-A2限制性表位特异性五聚体(pentamer)进行荧光染色,重组TCR在T细胞表面获得表达：其中在Jurkat细胞上转入的Vβ13链表达细胞占1.06%-2.25%,在HLA-A2阳性健康人T细胞上Vβ13阳性细胞和pentamer阳性细胞分别占到1.03%-2.06%和1.05%-1.12%,在HLA-A2阴性健康人T细胞上Vβ13阳性细胞和pentamer阳性细胞均低于0.05%。结论：1.经HBV抗原表位多肽诱导增殖的特异性CTL具有明显的TCRα、β链取用优势特点,这种TCR链的优势表达特点可能是影响抗HBV感染特异性细胞免疫力的重要分子基础。2.通过表位多肽诱导后,用流式细胞分选少量特异性CTL,再进行优势CTL克隆扩增,可以获得配对正确的CTL TCRα/β链基因,避免建立CTL稳定细胞系的困难。3.首次获得了HLA-A2限制性Env335-343表位特异性CTL TCR的编码基因,通过逆转录病毒介导获得HBV特异性TCR转基因表达,使非特异性T细胞获得了结合Env335-343表位的活性。