论文部分内容阅读
性别决定和调节机制是遗传学、发育生物学和进化生物学中最常见的科学问题之一。在脊椎动物的中,性别发生机制受多种因素的影响。遗传信息和环境因素占主导地位,通常分为两类:遗传性别决定（Genetic sex determination,GSD）和环境性别决定（Environmental sex determination,ESD）。ESD动物的性别不存在遗传上的差异,其性别取决于其胚胎发育过程中的环境条件,如温度、湿度、营养、激素、CO2、溶氧量、光周期等环境因素。其中,温度依赖型性别决定（Temperature-dependent sex determination,TSD）是ESD中最常见的性别决定模式。黄喉拟水龟（Mauremys mutica）是国家二级保护野生动物,在观赏、食用、药用和科研上均有很高的应用价值。黄喉拟水龟性别受温度调控,且雌雄个体差异较大,表现出“雌大雄小”的现象。同时,黄喉拟水龟属于从无脊椎动物向脊椎动物过渡的中间物种,它也是脊椎动物中研究温度依赖型性别决定的理想模型。迄今为止,有关黄喉拟水龟性腺发育和性别分化的研究报道较少,尤其是性别调控的分子机理仍缺乏研究。本研究以黄喉拟水龟为实验对象,通过对其产雄温度（Male-producing temperature,MPT）和产雌温度（Female-producing temperature,FPT）的六个胚胎发育时期转录组进行比较分析,筛选出了一系列潜在的响应温度变化的候选基因。因黄喉拟水龟是TSD动物,具有性别二态性,且雌雄个体差异较大,所以挑选已报道过的TSD动物性别决定或性别分化的明星基因（Foxl2和Cyp11b）为切入点,对Foxl2和Cyp11b进行克隆鉴定、表达分析及细胞定位研究,初步解析了Foxl2和Cyp11b在黄喉拟水龟性别分化及性腺发育中的生物学功能,详细的研究结果如下:1.黄喉拟水龟胚胎性腺比较转录组分析我们首先在黄喉拟水龟MPT和FPT的六个胚胎发育时期性腺进行比较转录组学分析,筛选出了几类响应温度变化的候选基因,例如热休克基因（Dnajb6a、Dnaja4、Hspa8和Hsp90aa1）、温度传感器基因（Mmp17、Mmp28、Tmco6、Gria3和Eif3f）和性别分化及性腺发育相关基因（Tex15、Insr、Igf1r、Cirbp、Esr1、Dmrt2和Serpinh1）。同时,比较分析了黄喉拟水龟和其他两种已报道的TSD龟（红耳龟和西部锦龟）的MPT和FPT不同时期性腺组织中的基因表达相似性和时程差异性,发现这三种TSD龟中存在8个共有基因,推测三者可能具有共同性腺特异性调节机制。这为后期阐明黄喉拟水龟和其他TSD龟的性别决定及性别分化机制提供基础数据。2.黄喉拟水龟Foxl2和Cyp11b的克隆及序列分析利用RACE（Rapid-amplification of c DNA ends）技术克隆了黄喉拟水龟Foxl2和Cyp11b的c DNA序列。其中,Foxl2 c DNA的序列长为2,574 bp,包括621 bp的5’非编码区（Untranslated region,UTR）、1,047 bp的3’非编码区（UTR）和906 bp的开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,共编码301个氨基酸;Cyp11b c DNA的序列长为1,305 bp,包括13 bp的5’非编码区（UTR）、15 bp的3’非编码区（UTR）和1,277bp的开放阅读框（ORF）,共编码434个氨基酸。通过不同氨基酸序列的多重比较和系统发育树的分析,发现黄喉拟水龟的Foxl2与乌龟的同源性最高;黄喉拟水龟与红耳龟、乌龟的亲缘关系较近,与哺乳类和鱼类的亲缘关系较远;黄喉拟水龟的Cyp11b与西部锦龟、红耳龟的同源性都比较高,相似度高达99.54%、98.62%,黄喉拟水龟与西部锦龟、红耳龟和乌龟的亲缘关系较近聚为一支。预测Foxl2和Cyp11b的蛋白质三级结构,发现它们各自存在一个保守的结构域。3.Foxl2和Cyp11b在黄喉拟水龟性腺发育过程中的表达及细胞定位分析RT-q PCR结果显示:在成体黄喉拟水龟各组织中,Foxl2的表达水平在卵巢组织中最高,Cyp11b的表达水平在精巢组织中最高,两者在其他组织中的表达水平均很少;在FPT和MPT胚胎性腺中,Foxl2在FPT胚胎性腺的表达显著高于MPT胚胎性腺,而Cyp11b则刚好相反,其在MPT胚胎性腺的表达显著高于FPT胚胎性腺。对黄喉拟水龟MPT和FPT的不同发育时期胚胎性腺组织进行切片观察,结果显示:MPT的胚胎性腺的髓质区较发达,具有典型的原始性索结构（含有大量的生殖细胞）,而其皮质区很薄（仅有1层细胞）;与此形成对照的是,FPT的胚胎性腺的皮质区比较发达（含有大量的生殖细胞）,较厚（有大约3-4层细胞）,而髓质区则退化严重,有部分中空现象且生殖细胞很少或基本没有。MPT和FPT的不同胚胎时期的原位杂交结果显示:Foxl2 m RNA的显色信号主要表达在FPT胚胎性腺的皮质区,而髓质区表达量很少或基本无信号;与之相反,Cyp11b m RNA的显色信号主要表达在MPT胚胎性腺的髓质区,而皮质区表达量很少或基本无信号。综上所述,Foxl2和Cyp11b参与了黄喉拟水龟的性别分化及性腺发育过程;这为进一步明晰黄喉拟水龟温度依赖型性别决定的分子机制提供了理论依据。