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背景与目的:随着我国逐步进入老龄化社会加之人民饮食结构的变化,前列腺癌的发病率也随之提高。大多数前列腺癌患者经过常规治疗方法治疗后会转化为激素非依赖性前列腺癌和难治性前列腺癌。上述两型前列腺癌尤其是难治性前列腺癌对目前任何常规治疗均不敏感,为临床预防和治疗工作带来极大的困难。因此,在临床实际工作中迫切寻找新的防治手段解决目前难题。近年来,众多流行病学研究显示,非甾体类药物(NSAIDs)对乳腺癌、呼吸系统肿瘤、消化道肿瘤及泌尿系统肿瘤等有一定的预防治疗作用,其主要机制可能与其抑制肿瘤细胞中环氧化酶-2(COX-2)和脂氧合酶的表达有关。选择性COX-2抑制剂对肿瘤新生血管生成及其对肿瘤细胞生长、转化、增殖和凋亡的影响取得了重大进展,为肿瘤的预防和治疗开辟新的有效途径提过了理论依据和实验基础。目前,国内外关于选择性COX-2抑制剂对前列腺癌细胞影响的研究并不多。本文的研究目的在于研究选择性COX-2抑制剂—塞来昔布(Celecoxib)对前列腺癌DU-145细胞凋亡及侵袭力的影响,并探讨其可能作用机制,为非激素依赖型前列腺癌及难治性前列腺癌的防治提供新的思路和实验的理论基础。内容:本实验以非激素依赖性前列腺癌DU-145细胞株为研究对象,与实验药物塞来昔布作用后,观察其是否有凋亡现象同时检测其凋亡率,并检测塞来昔布作用后,细胞中凋亡相关基因和肿瘤细胞侵袭力相关基因表达情况,从而初步探讨塞来昔布在前列腺癌凋亡发生中的作用。方法:1、使用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养非激素依赖性前列腺癌DU-145细胞,适时进行细胞换液、传代。实验所用细胞为状态良好的对数生长期细胞。2、将浓度为50μmol/L实验药物塞来昔布加入细胞培养作用24小时后进行Hoechst 33342/PI双染色处理,在荧光显微镜下观察并拍照进过染色剂处理的细胞,观察其凋亡形态,并与空白对照组对比;3、根据塞来昔布的浓度将培养细胞分为5组,即0,25,50,100,200μmol/L组。根据组别将塞来昔布加入对应培养细胞中作用24小时,进行FITC-AnnexinV/PI双染色流式细胞术检测不同浓度塞来昔布诱导细胞凋亡率大小。实验重复三次。数据详细记录并归纳后进行统计分析;4、将浓度为50μmol/L的塞来昔布作用于前列腺癌DU-145细胞24小时后,应用RT-PCR法检测Bcl-2、E-cadherin、ICE及COX-2基因的mRNA表达水平并与空白对照组相对比,取PCR产物于体积分数为2%的琼脂糖凝胶中电泳30min,紫外灯下观察并拍照,使用Gel-proAnalyzer 4.0软件分析扩增产物的光密度(optical density,OD)。详细记录数据并归纳后进行统计学分析。结果:1、Hoechst 33342/PI双染色可观察到药物作用后,与空白对照组相比,实验组细胞呈现明显凋亡现象。2、FITC-Annexin V/PI双染色流式细胞术证实,塞来昔布能有效诱导细胞凋亡,0、25、50、100、200μmol/L塞来昔布诱导细胞凋亡率分别为(1.10±0.15)%,(3.87±0.79)%,(10.59±1.58)%,(22.50±3.30)%,(33.85±2.71)%,实验组与空白对照组凋亡率差异经统计分析均有统计学意义(P<0.05)细胞凋亡率呈现浓度依赖性递增。3、RT-PCR显示塞来昔布作用后,细胞中Bcl-2 mRNA表达水平下调, E-cadherin mRNA表达水平上调,ICE mRNA表达水平无明显变化,而COX-2 mRNA未检测到。结论:1、通过Hoechst 33342/PI双染色实验,我们可以观察到明显的细胞凋亡现象,可以推断,塞来昔布作为选择性COX-2抑制剂能够有效地诱导非激素依赖型前列腺癌DU-145细胞凋亡。2、通过FITC-Annexin V/PI双染色流式细胞术实验,我们对细胞凋亡进行了定量测量,证实了塞来昔布诱导前列腺癌细胞凋亡时,其凋亡率为药物浓度依赖性,即凋亡率与药物浓度成正相关关系。3、通过RT-PCR实验我们检测了四种细胞凋亡相关基因及肿瘤侵袭力相关基因的mRNA表达情况。在实验过程中并未检测出COX-2表达,推断塞来昔布诱导非激素依赖型前列腺癌的细胞株DU-145可能通过“COX-2非依赖”途径实现,而不是传统理论所指“COX-2依赖”途径,这为我们对塞来昔布这一选择性COX-2抑制剂有了新的认识。经过实验药物塞来昔布作用后,实验组细胞Bcl-2基因表达水平下调,Bcl-2家族为细胞程序性死亡的重要调节因子,具有抑制细胞凋亡的作用,参与细胞凋亡中线粒体介导的通路,通过本实验我们证实Bcl-2基因mRNA水平下调,提示塞来昔布可能参与线粒体凋亡通路。同时我们选择另一凋亡相关基因ICE,它也是细胞凋亡重要的调节因子,是细胞凋亡另外一条重要通路—Fas凋亡通路的核心,是凋亡中心控制和凋亡发生效应的调节因子。本实验结果显示ICE基因在实验组和空白对照组中没有明显差异,因此我们推断塞来昔布诱导前列腺癌细胞凋亡可能独立于Fas凋亡途径。E- cadherin是调节细胞与细胞之间,细胞与基质之间粘附反应的重要媒介,对维持细胞及组织形态起重要作用。在多种肿瘤细胞生长过程中,其侵袭行为与E-cadherin功能丧失有关。本实验结果显示塞来昔布作用后前列腺癌细胞中E-cadherin mRNA表达水平上调,提示塞来昔布提高了前列腺癌细胞间粘附作用,从而达到降低前列腺肿瘤细胞的侵袭转移的能力。综上所述,我们在实验中证实了,塞来昔布作为选择性COX-2抑制剂可以诱导激素非依赖性前列腺癌DU-145细胞凋亡并首次对肿瘤的侵袭能力做了进一步探讨,证实塞来昔布降低了肿瘤细胞侵袭能力,从而增加其抗肿瘤的作用,这为治疗激素非依赖性前列腺癌提供了实验依据,对前列腺癌的化学预防及治疗具有潜在的应用前景。