土壤盐碱化是一个世界性的问题，现在进行盐地开发的有效途径是培育新型的耐盐作物品系。草业可持续发展是我国经济实现可持续发展的重要保证，而抗旱、耐盐碱牧草育种则是我国草业发展的重大技术需求和提高农业产量的一项基本国策。高羊茅（tallfescue，Festuca arundinacea Schreb．）属于禾本科羊茅属（Festuca），为多年生草本植物。高羊茅是一种多年生冷季型草，营养价值极高，具有耐瘠薄、抗锈病、适应性强等特性，作为牧草和草坪草都有广泛的应用。利用基因工程技术改良其耐逆性对保持草坪四季常绿，节约水资源，扩大建植区域，尤其是对改善我国西部地区的生态环境具有十分重要的意义。作为“国家十五重大科技专项—转基因植物研究与产业化专项课题”的资助项目之一，本研究建立了高羊茅组织培养再生体系、构建Na⁺／H⁺逆向转运蛋白基因遗传转化载体、建立了有效的农杆菌介导高羊茅转基因方法、对转基因植株完成了分子鉴定和遗传分析及后代的耐盐性测定，获得耐逆性增强的转基因T₂代株系，为牧草转基因新品种的培育奠定了基础。此外，本实验从耐盐植物高冰草及小麦／高冰草体细胞杂种耐盐小麦新品种山融3号中分别克隆了与耐逆相关的Na⁺／H⁺逆向转运蛋白基因和过氧化物酶基因，初步分析其在植物耐逆中的可能作用。1．Na⁺／H⁺逆向转运蛋白基因AtNHX1对高羊茅耐盐的作用盐碱地对于植物生长的影响主要是通过Na⁺对细胞的毒害作用引起。本实验建立了8种高羊茅下胚轴组织培养再生体系，以其中4种Forager、BLASER、G1和Fine-Lawn的胚性愈伤组织为材料，将筛选基因nptⅡ和由烟草CaMV 35S和玉米Ubiquitin启动子驱动的拟南芥Na⁺/H⁺逆向运输蛋白基因导入这4个品种中，建立了农杆菌介导的高羊茅遗传转化体系并且获得了可遗传的高羊茅转基因后代。T_o代PCR分析和基因组Southern杂交鉴定证实了AtNHX1基因已经整合到高羊茅基因组中，并以单拷贝或双拷贝形式存在。T₁-T₂代的PCR和Southern杂交证实转基因后代遗传了AtNHX1，RT-PCR分析表明外源基因AtNHX1在转基因后代中表达，并且不同株系的表达量有差异。通过耐盐生理指标分析转基因高羊茅后代的耐盐性，证明转基因高羊茅通过Na⁺在液泡中的区隔化，降低了叶片细胞质中Na⁺浓度，从而提高植株的耐盐性。通过上述实验，我们从转基因T₂株系中选出4个单拷贝插入、遗传稳定、耐盐性强的株系申请安全性环境释放，已经获得农业部批准（批准号：No．2006-T048）。本研究为高羊茅的基因工程育种与遗传改良奠定了基础。2．单子叶耐盐植物Na⁺／H⁺逆向转运蛋白基因的全长cDNA克隆及与拟南芥该基因对植物耐盐性的比较研究本实验从耐盐植物高冰草（Agropyron elongatum Host Nevski）中克隆了Na⁺／H⁺逆向转运蛋白基因的全长cDNA序列TeNHX1和TeNHX2，并且与其它植物进行了聚类分析。通过盐敏感酵母突变体（AXT3）互补实验比较了高冰草TeNHX1、TeNHX2、高羊茅FaNHX（本实验室克隆）和拟南芥AtNHX1对耐盐性的不同贡献。结果表明：TeNHX1、TeNHX2、FaNHX1的氨基酸序列与滨藜、水稻、大麦、小麦Na⁺／H⁺逆向转运蛋白具有较高的同源性，高冰草TeNHX1与小麦TaNHX及水稻OsNHX2较近缘，而高冰草TeNHX2与大麦HvNHX1及水稻OsNHX1的亲缘关系更近一些。在200 mM盐浓度下，FaNHX1和TeNHX1对酵母突变体的互补效果最好，其次是TeNHX2，而AtNHX1最差，这可能是由于非保守区序列上的差异造成了不同植物Na⁺／H⁺逆向转运蛋白活性不同。对高冰草的RT-PCR分析表明：NHX基因的表达具有组织特异性，在盐处理下表达量有变化，这与其区隔化Na⁺的功能一致。在没有盐诱导的条件下，根和叶中均有表达，说明在正常生长条件下NHX也具有维持细胞内离子平衡的作用，NHX在转录水平的调节可能是决定植物耐盐能力的重要因素。分别构建了这几个不同来源Na⁺／H⁺逆向转运蛋白基因的表达载体，对单／双子叶模式植物拟南芥／水稻进行遗传转化，为进一步通过过量表达分析基因功能奠定了基础。为不同植物NHX基因功能的比较研究及其在基因工程中应用以及评价不同学者对NHX基因功能的争议提供理论依据和实验基础。3．小麦与高冰草体细胞杂种耐盐新品种山融3号耐逆相关过氧化物酶基因的克隆利用不对称体细胞杂交技术可向小麦转移异源植物的耐盐基因。本实验室以普通小麦（Triticum aestivum L）济南177胚性悬浮细胞来源的原生质体为受体，野生耐盐近源植物高冰草（Agropyron elongatum Host Nevski）悬浮细胞系原生质体经紫外线照射后为供体，进行不对称体细胞杂交，在国际上首次获得了体细胞杂种后代株系。经过连续多年的实验室及大田耐盐实验，已筛选出耐盐新品种山融3号。利用mRNA差异显示技术、基因芯片信息和RACE技术，从山融3号中克隆和分离了盐胁迫相关的过氧化物酶全长cDNA序列TaPOD和TaPOX。TaPOD开放阅读框编码322aa，编码蛋白质分子量为33.3 kD，推测等电点pI=6.11。NCBI中BLAST结果表明，该序列编码classⅢperoxidase，与水稻中的同源基因的蛋白相似性达到85％，跨膜区分析表明其含有两个跨膜区。TaPOX开放阅读框编码342aa，编码蛋白质分子量为36.5 kD，推测等电点pI=5.81。NCBI中BLAST结果表明，该序列编码peroxidase，与一粒小麦中的同源基因Triticum monococcum peroxidase 10的蛋白相似性达到98％，含有两个跨膜区。高冰草、济南177和山融3号的基因组的Southern杂交分析表明：TaPOD基因在高冰草、济南177和山融3号的基因组中存在多个拷贝或同源基因。山融3号基因组中杂交信号数目介于两个亲本之间，并且有不同于亲本的杂交信号产生，表明山融3号的耐盐性可能与TaPOD基因相关。进一步采用RT-PCR的方法分析了山融3号中TaPOD和TaPOX在逆境下的表达模式，从而探讨了它们在抵抗逆境反应中可能的功能。RT-PCR和Northern杂交表明：TaPOD基因在NaCl胁迫6小时的山融3号根中表达量明显增强／叶中表达无明显差异；而在济南177的叶中受盐胁迫诱导表达／根中盐胁迫早期表达下调。PEG处理后，在山融3号的根、叶以及济南177的根中，TaPOD表达量均无明显差异，但是在177的叶中，TaPOD表达量在PEG胁迫初期表达下调，随着胁迫时间的延长其表达量又上升。TaPOX基因在山融3号根中随着PEG胁迫时间的延长表达量逐渐增强，在正常山融3号的叶中不表达，但是在胁迫初期（1小时）表达上调；该基因在177的根和叶均为胁迫初期表达量降低，而后随着胁迫时间的延长表达量又有上升。这些结果表明过氧化物酶基因通过转录水平的变化调节小麦的耐逆性。根据本实验室对山融3号和JN177的双向电泳—质谱的分析结果，从山融3号盐胁迫诱导特异表达的蛋白点中检测到多个过氧化物酶，其中POX10与本实验TaPOX对应。对比本实验室基因芯片分析结果表明，盐胁迫下TaPOD在山融3号的根中表达上调，在济南177的根中表达下调：而盐胁迫下TaPOX在山融3号和济南177的根中表达均为上调。芯片分析发现有两类过氧化物酶在山融3号的特异表达，表明有两种不同类型的过氧化物酶分别参与干旱和高盐胁迫，二者参与胁迫的机制不同。这些结果初步表明：在盐害与干旱胁迫时，山融3号基因组中与抗氧化胁迫相关的基因起重要作用。这些新基因都可望用于牧草的耐盐基因工程育种。利用TaPOD基因对山融3号进行了遗传转化，PCR和Southern杂交分析证明该基因已经插入到山融3号基因组。对转化植株的POD同工酶分析表明：过表达TaPOD的转基因山融3号小麦的POD同工酶谱发生明显变化，比山融3号多了1～3条POD谱带。过氧化物酶是一种对环境条件十分敏感的氧化酶类，其同工酶（POD）谱带的变化在一定程度上能反映植物抗盐性的强弱。过氧化物酶酶活性测定表明大多数过表达TaPOD的转基因SR3小麦的过氧化物酶酶活性明显增强。下一步工作的重点是过氧化物酶相关基因的过量表达和过氧化物酶活性的提高与植物耐逆性的对应关系及相关信号转导通路的研究。