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背景:肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）由肿瘤细胞周围的成纤维细胞、内皮细胞、炎性细胞、免疫细胞及细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）构成,其是肿瘤赖以生存和持续发展的重要条件和基础。TME能够直接影响肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及分化。作为TME最主要的功能细胞——癌相关成纤维细胞（cancer associated fibro-blasts,CAFs）,能够通过细胞—细胞接触,分泌大量细胞因子和产生大量的 ECM,直接或间接的调控肿瘤的发生发展、迁移和侵袭。目前认为,CAFs来源于肿瘤招募的骨髓间质干细胞、外膜周围细胞（包括外膜细胞和血管平滑肌细胞）、内皮细胞及宿主成纤维细胞,其中,宿主成纤维细胞是CAFs最主要的来源。研究证实,转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）是成纤维细胞活化及CAFs转化最重要的调控因子,TGF-β1能够诱导宿主成纤维细胞活化为CAFs,继而促进肿瘤的发生、发展。前期研究发现,作为TGF-β1重要的下游靶点,Ca2+信号也参与了这一过程。钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/Calmodulin dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ）是细胞内Ca2+信号最重要的调控蛋白,广泛作用于细胞周期的调控、凋亡、基因表达及细胞分泌等多种生理过程。虽然已有研究证实CaMKⅡ在肿瘤发展、迁移及侵袭中发挥着重要作用,但其在TGF-β1诱导结肠成纤维细胞向CAFs转化及CAFs与结肠癌相互影响中的作用和机制并不明确,因此,本研究将深入探讨CaMKⅡ在上述过程中的重要作用和机制,为结肠癌的防治寻找新的靶标和策略。第一部分CaMKⅡ在人正常结肠组织、癌旁组织及结肠癌组织表达的研究目的:研究CaMKⅡ在人正常结肠组织、癌旁组织及结肠癌组织中表达的意义。方法:分别选取人正常结肠组织石蜡包埋标本16例、癌旁组织石蜡包埋标本16例、结肠癌组织石蜡包埋标本16例为研究对象,分别采用免疫组织化学和免疫组织荧光检测CaMKⅡ及平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）的表达。结果:CaMKⅡ在结肠癌间质的表达明显高于正常结肠黏膜和癌旁组织（P<0.05）,α-SMA同样在结肠癌组织呈高表达而在正常结肠黏膜和癌旁组织呈低表达。结论:CaMKⅡ在不同的结肠组织中表达差异,且间质高表达的CaMKⅡ主要来源于CAFs。CaMKⅡ可能参与调控结肠成纤维细胞的活化及CAFs的转化。第二部分CaMKⅡ在TGF-β1诱导结肠成纤维细胞活化中的作用和机制研究目的:研究JCaMKⅡ在TGF-β1诱导结肠成纤维细胞活化中的调控作用及具体机制。方法.:构建CaMKⅡ α-shRNA和阴性对照shRNA慢病毒载体转染人结肠成纤维细胞株CCD-18Co。用TGF-β1（5ng/mL）及相关信号通路阻断剂（SIS3、PD98059、SP600125、SB203580、LY294002）处理上述细胞,蛋白免疫印迹（Western blot）和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测上述细胞中CaMKⅡα、α-SMA、成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein,FAP）、纤维连接蛋白（fibronectin,FN）、smad3、p-AKT/AKT、p-ERK1/2/ER K、p-JNK/JNK、p-p38/p38 的表达水平。MTT法检测不同干预下CCD-18Co细胞的增殖,Transwell和细胞划痕试验检测CCD-18Co细胞的迁移运动能力,酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测培养基上清中血小板源生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors,FGF）的水平。结果:CaMKⅡα-shRNA转染的CCD-18Co细胞中CaMKⅡα的表达明显低于空白对照组和阴性对照组（P<0.05）。TGF-β1诱导下,CCD-18Co细胞CaMKⅡα、α-SMA、FAP、FN的表达及培养基中PDGF、EGF、FGF的分泌显著增加（P<0.05）,细胞增殖和迁移能力增强（P<0.05）。CaMKⅡα-shRNA显著降低TGF-β1诱导的CAFs分子标记α-SMA、FAP、FN及生长因子PDGF、EGF、FGF的表达（P<0.05）,减弱TGF-β1诱导的CCD-18Co细胞增殖和迁移（P<0.05）。TGF-β1 刺激下,CCD-18Co 细胞 Smad3、p-AKT、p-ERK1/2、p-p38 的表达显著增加（P<0.05）,p-JNK/JNK 的表达无明显变化（P>0.05）,CaMKⅡα-shRNA 显著减少TGF-β1诱导的上述信号通路分子的表达（P<0.05）。信号通路阻断剂SIS3、PD98059、SB203580、LY294002 减弱 TGF-β1 诱导的 CCD-18Co 细胞增殖及 CAFs分子标记α-SMA、FAP、FN及生长因子PDGF、EGF、FGF的表达（P<0.05）,SP600125对TGF-β1的诱导作用没有影响（P>0.05）。结论:CaMKⅡ是TGF-β1诱导结肠成纤维细胞活化及向CAFs转化中重要的调控分子。Smad3,AKT及MAPK信号通路可能参与TGFβ1-CaMKⅡ诱导结肠成纤维细胞活化及向CAFs转化。第三部分CaMKⅡ在结肠成纤维细胞与结肠癌细胞相互影响中的作用及机制研究目的:研究CaMKⅡ在结肠成纤维细胞与结肠癌细胞相互影响中的作用及调控机制。方法:应用transwell构建结肠成纤维细胞CCD-18Co和人结肠癌细胞HCT116的体外共培养（co-culture）体系。共培养72小时后,Western bolt、qRT-PCR及细胞免疫荧光检测共培养条件下CCD-18Co细胞CaMKⅡα、α-SMA、FAP、FN 和 HCT116 细胞 MMP2、MMP9、TIMP-1 的表达,CCK-8 检测 CCD-18Co细胞和HCT116细胞的增殖。共培养24小时后transwell检测CCD-18Co细胞和HCT116细胞的迁移及HCT116细胞的侵袭能力。结果:与结肠癌细胞HCT116共培养后,CCD-18Co细胞CaMKⅡ、α-SMA、FAP、FN的表达显著增加（P<0.05）,增殖和迁移能力增强（P<0.05）,CaMKⅡα-shRNA组CCD-18Co细胞没有显著变化（P>0.05）。与CCD-18Co细胞共培养后,结肠癌细胞HCT116的MMP2、MMP9表达增加,TIMP-1的表达减少（P<0.05）,增殖、迁移和侵袭能力增强（P<0.05）,CaMKⅡα-shRNA组HCT116细胞没有显著变化（P>0.05）。结论.:结肠癌细胞能够诱导结肠成纤维细胞活化及向CAFs转化,结肠成纤维细胞能够促进结肠癌细胞的生长、迁移和侵袭,此过程依赖于CaMKⅡ的调控作用。