肝纤维化(hepatic fibrosis)是肝硬化的共同病理基础和必经阶段,是影响慢性肝病的重要环节,因此肝纤维化的预防、治疗乃至逆转是阻断肝硬化的关键环节。肝纤维化也成为国内外学者研究慢性肝病的焦点。我国是肝病高发国家,以慢性乙型、丙型病毒性肝炎最为常见,在目前尚无良好的抗病毒药物的情况下,阻止或逆转肝纤维化进程成为治疗慢性肝病的重要对策。肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)是肝纤维化形成过程中的关键细胞成分,是肝内细胞外间质(extracellular matrix, ECM)的主要细胞来源,因此抑制HSCs活化与增殖则成为阻止并逆转肝纤维化的主要途径之一。细胞迁移是机体正常生长发育以及组织损伤、修复和炎症反应必不可缺的病理生理过程,在肝组织修复及肝纤维化形成过程中,损伤局部大量HSCs聚集可能与HSCs定向迁移有关。细胞迁移涉及到细胞骨架、细胞黏附相关的动态组装和空间位置的变化。从细胞生物学相关研究结果来看,细胞黏附、铺展和迁移是一复杂且尚未完全阐明的细胞内信号转导通路调控的病理生理过程。近年来,Rho/ROCK信号转导通路在多种器官组织慢性炎性纤维化中的作用受到了日益广泛的关注。有研究表明,选择性阻断该信号通路可以改善纤维化器官的进展和预后,但其在肝纤维化进程中的作用机制目前尚不清楚。目前,该信号通路选择性抑制剂国内外均能生产,如该研究达到预期效果,将为肝纤维化的治疗提供一种新的选择。为此,我们从HSCs迁移着手,以ROCK-I、磷酸化肌球蛋白结合亚单位(myosin binding subunit , MBS Thr-697)、α-SMA为切入点,有机结合整体和离体实验,研究了Rho/ROCK信号转导通路在实验性大鼠肝纤维化形成和大鼠HSCs迁移过程中的作用。实验内容主要包括以下3部分:第一部分:大鼠肝纤维化组织ROCK-I、磷酸化MBS Thr-697、α-SMA的动态表达目的:探讨ROCK-I、磷酸化MBS Thr-697、α-SMA蛋白及其mRNA在实验性大鼠肝纤维化形成过程中的动态表达及肌动蛋白细胞骨架的变化。方法:采用胆总管结扎(bile duct ligation, BDL)方法制备大鼠肝纤维化模型,将80只雄性Sprague Dawley大鼠随机分成假手术组和模型组。模型组分别于结扎后1wk、2wk、3wk、4wk麻醉动物,假手术组与4wk模型组同批麻醉。采用HE及Masson三色染色确定模型建立情况;免疫组织化学、Western blot与RT-PCR方法研究ROCK-I、α-SMA蛋白及其mRNA在肝纤维化不同时期肝组织中的分布及含量的动态变化;采用Western blot方法检测ROCK-I底物—肌球蛋白磷酸酶结合亚单位第697位苏氨酸(MBSThr-697)的磷酸化水平,作为Rho/ROCK信号转导通路活化指标;采用特异性荧光染色方法检测肝纤维化不同时期肌动蛋白细胞骨架的变化。结果:①随着肝纤维化的发展,大鼠肝脏中ROCK-I、α-SMA阳性细胞明显增多,主要分布在汇管区、纤维间隔及增生的胆管周围细胞,造模1~4wk大鼠肝组织ROCK-I (14.71%±4.01%、20.66%±2.34%、26.21%±1.74%、32.50%±2.55%)、α-SMA (13.62%±1.48%、23.25%±2.02 %、27.92%±1.61%、33.69%±1.99%)的阳性面积显著性高于正常组(5.35%±1.30%、6.22%±1.56%),P<0.05。②Western blot结果显示,正常大鼠ROCK-I蛋白表达水平较低,在肝纤维化发生早期即出现表达上调,至病变后期仍维持较高水平,模型组1~4wk其表达分别较正常对照组增加0.83倍、1.14倍、1.96倍、2.33倍,假手术组与对照组之间无明显差异,P>0.05;磷酸化MBS Thr-697蛋白模型组1~4wk分别较正常对照组增加0.80倍、1.37倍、2.29倍和3.34倍,假手术组与对照组之间无明显差异,P>0.05;α-SMA蛋白模型组1~4wk分别较正常对照组增加0.48倍、0.87倍、1.49倍和2.10倍,假手术组与对照组之间无明显差异,P>0.05。③RT-PCR结果显示,正常大鼠肝组织中有α-SMA基因表达,模型组第2天(264.69±30.28)即出现表达上调,至第21天(817.33±67.60)达高峰后有所下降,至模型后期(801.67±78.50)仍高于基础表达(245.33±27.16)。ROCK-I电泳条带的光密度扫描显示,正常大鼠肝组织中就有ROCK-I基因表达,在纤维化发生早期即出现明显上调,至第14天(722.67±86.08)达高峰而后下降,至病变后期(第28天)(707.00±82.79)仍高于基础表达(276.33±37.45),并且与α-SMA表达呈显著性正相关(r=0.718,P<0.05)。④用FITC标记的鬼笔毒环肽荧光染色,激光共聚焦扫描显微镜观察,正常大鼠肝脏F-actin位于细胞周边,可见少量肌动蛋白丝,随着造模时间延长,肝组织荧光信号增强。结论:肝纤维化形成过程中,ROCK-I、磷酸化MBS Thr-697和α-SMA表达明显增加,提示ROCK-I在肝纤维化发生过程中不但有表达上调,而且有功能活化;ROCK-I mRNA表达水平较α-SMA提前达峰值,提示ROCK-I可能通过诱导肌成纤维细胞表型形成而参与肝纤维化的发生;肝纤维化形成过程中,随着造模时间延长,可见大鼠肝组织特异性荧光信号增强,细胞间规则网状结构消失,提示肝纤维化时肌动蛋白大量增生,同时发生细胞骨架重组。第二部分:ROCK-I抑制剂Y-27632抑制大鼠肝星状细胞黏附与迁移目的:观察Rho/ROCK信号通路特异性阻断剂Y-27632对大鼠HSCs ROCK-I、磷酸化MBS Thr-697、α-SMA表达及HSCs黏附、迁移和细胞骨架的影响,探讨该信号通路在HSCs黏附、迁移过程中的作用。方法:应用体外细胞培养技术,采用MTT法测定HSCs增殖;甲苯胺蓝染色法测定HSCs黏附率;Boyden小室跨膜迁移分析法测定HSCs迁移;FITC标记鬼笔毒环肽测定HSCs细胞骨架变化;Western blot测定ROCK-I底物—磷酸化MBS Thr-697蛋白表达,作为Rho/ROCK信号转导通路活化指标;采用RT-PCR方法研究ROCK-I、α-SMA mRNA在HSCs不同干预组的变化。结果:①不同浓度Y-27632作用于HSCs 24h,10μmol/L Y-27632细胞黏附抑制率为2.56%,与对照组相比无明显差异(P>0.05);20μmol/L、30μmol/L Y-27632组细胞黏附抑制率分别为31.21%,60.91%,与正常对照组相比,细胞黏附率明显下降,有统计学意义(P<0.05)。②10、20、30μmol/L Y-27632作用于HSCs24h,其细胞生长抑制率分别为5.98%、25.36%、33.24%;20μmol/L Y-27632作用于HSCs12h、24h、48h后其细胞生长抑制率分别为17.58%、25.36%、46.93%,说明Y-27632具有抑制HSCs增殖作用,在一定浓度范围内,呈明显的时间和剂量效应关系。③细胞跨膜迁移结果分析显示:对照组12h、24h、48h跨膜细胞数分别为23.40±5.19、33.20±8.27和38.60±9.23;20μmol /L Y-27632作用于HSCs12h、24h、48h后,其跨膜细胞数分别为19.30±4.19、13.00±3.32和7.9±2.42,与对照组比较有统计学意义(P<0.05)。④Y-27632作用于HSCs 24h后,ROCK-I蛋白较对照组降低0.25倍,ROCK-I基因表达强度较对照组降低52%,p-MBS Thr-697蛋白较对照组降低0.36倍,α-SMA蛋白较对照组降低0.47倍,α-SMA基因表达强度较对照组降低0.47倍。⑤用FITC标记的鬼笔毒环肽荧光染色,激光共聚焦显微镜观察,LPA诱导HSCs 20min后,出现粗而长的应力纤维,周边肌动蛋白丝带模糊甚至消失,Y-27632作用于HSCs 20min后,周边肌动蛋白丝带连续、光滑,应力纤维消失。结论:体外细胞培养研究表明,ROCK-I特异性抑制剂Y-27632可以抑制LPA诱导的HSCs增殖、黏附和迁移,在一定浓度范围内,呈明显的剂量依赖性和时间依赖性;Y-27632可以抑制HSCs ROCK-I、α-SMA和p-MBS Thr-697的表达;特异性荧光检测F-actin研究表明,ROCK-I特异性抑制剂Y-27632可部分预防和逆转LPA诱导的HSCs骨架重组。第三部分:法舒地尔对实验性大鼠肝纤维化组织及肝星状细胞迁移的抑制作用目的:观察ROCK-I选择性阻断剂法舒地尔对大鼠肝纤维化组织ROCK-I、α-SMA、磷酸化MBS Thr-697表达及HSCs黏附、迁移和细胞骨架的影响。方法:从动物、细胞实验两方面,应用免疫组织化学方法测定肝组织ROCK-I、α-SMA表达;Western blot方法测定肝组织和HSCs ROCK-I、α-SMA、磷酸化MBS-Thr697表达;RT-PCR方法测定肝组织和HSCs ROCK-I、α-SMA mRNA表达;免疫细胞化学测定HSCs ROCK-I、α-SMA表达;特异性荧光染色检测细胞骨架变化。结果:①BDL+法舒地尔注射组造模1~4wk大鼠肝组织ROCK-I (6.49%±3.78%、9.32%±2.05%、10.37%±2.56%、12.41%±3.79%),α-SMA (7.16%±1.89%、9.53%±2.18%、12.39%±3.46%、15.15%±4.68%)的阳性面积均显著低于BDL组和BDL+生理盐水注射组(P<0.05)。②Western blot结果显示,BDL+法舒地尔注射组,造模第4wk ROCK-I蛋白较BDL组降低了38.68%,p-MBSThr-697蛋白较BDL组降低了30.69%,α-SMA蛋白较BDL组降低了20.50%。RT-PCR结果显示,BDL+法舒地尔注射组造模第4wk ROCK-I mRNA较BDL组降低了32.39%,α-SMA mRNA较BDL组降低了34.46%。③法舒地尔作用于HSCs 12h、24h、48h,细胞黏附抑制率分别为19.25%、34.55%和68.22%,其跨膜细胞数分别为17.54±3.26、11.25±2.55和8.13±1.24,均明显低于对照组,P<0.05。④Western blot结果显示,法舒地尔作用于HSCs 24h后,ROCK-I蛋白较对照组降低0.43倍,磷酸化MBSThr-697较对照组降低0.43倍,α-SMA蛋白较对照组降低0.48倍;RT-PCR结果显示,法舒地尔作用于HSCs 24h后,ROCK-I mRNA较对照组降低0.55倍,α-SMA mRNA较对照组降低0.52倍。⑤FITC标记的鬼笔毒环肽荧光染色结果显示,BDL+法舒地尔注射组与BDL组相比,可见大鼠肝组织细胞间网状结构稍规则,周边肌动蛋白丝带连续,荧光信号减弱。LPA诱导HSCs 20min后,再加入25μmol /L法舒地尔孵育30min,HSCs周边肌动蛋白丝带变细,应力纤维明显减少。结论:ROCK-I选择性阻断剂法舒地尔可抑制BDL大鼠模型肝组织ROCK-I、p-MBSThr-697、α-SMA转录及翻译水平表达;体外细胞培养研究表明,阻断剂法舒地尔可抑制LPA诱导的HSCs黏附和迁移,在一定浓度范围内呈明显的时间依赖性,同时法舒地尔可抑制LPA诱导的HSCs表达ROCK-I、p-MBSThr-697、α-SMA;特异性荧光检测F-actin研究表明,法舒地尔可部分抑制BDL大鼠肝组织F-actin重构,同时可部分预防和逆转LPA诱导的HSCs骨架重组。