1991年首例Cry3Aa蛋白结构成功解析以来,苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白结构生物学研究的不断深入,有力地推动了蛋白作用机制等研究领域的快速发展,促进了苏云金芽胞杆菌在农林业中更加广泛的应用。为了进一步揭示新型杀虫晶体蛋白的结构,探索杀虫蛋白的作用机理,扩大苏云金芽胞杆菌的应用范围,缓解与防治田间害虫中出现的抗性,本研究以我室新克隆表达的Cry51Aa1蛋白为对象,利用X射线晶体学衍射技术,较全面而深入地开展了结构及功能的探索。结果如下:1.解析出与经典三结构域型Cry蛋白不同,且对马铃薯甲虫幼虫有特异性毒性的Cry51Aa1全长蛋白结构。创建了苏云金芽胞杆菌新颖蛋白结构与杀虫活性之间的新型关系,此项研究国内尚未见诸报道。同时,将已解析的苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白结构的分辨率刷新至1.65?。2.Cry51Aa1蛋白结构主要由β折叠股组成,按结构特性可分为三个结构域:结构域I位于整个结构的氨基端,由α螺旋、310螺旋和β折叠股组成;结构域II位于整个结构的中段,由β发卡和β片层构成;结构域III位于整个结构的羧基端,含有两个β片层。结构域II和结构域III均呈‘β三明治’构象。3.Cry51Aa1蛋白三个结构域具有其自身的特点:结构域I富含芳香族氨基酸,可能与受体结合以及结构稳定性相关;结构域II富含色氨酸与苏氨酸,并含有一个两亲性β发卡结构和一段甘氨酸loop,这些模块可能参与蛋白的多聚和跨膜穿孔过程;结构域III含有完整的羧基尾端,与蛋白酶酶解活化过程紧密联系。4.Cry51Aa1在非对称单元内以单体形式存在,但在晶体与溶液中呈晶体学二聚体状态。对结构进一步分析表明,Cry51Aa1蛋白经胰蛋白酶酶解活化后,二聚体内分子间氢键被破坏,二聚体裂解形成单体,单体聚集产生六聚体,六聚体可能是蛋白与细胞膜相互作用时的多聚形态。酶解亦会破坏蛋白单体内各结构域之间的氢键,从而影响两亲性β发卡结构的稳定性。5.本研究根据螺旋和β折叠组成及分布特点的相似性,三维结构空间分布相似性、以及典型的两亲性β发卡结构特征,将Cry51Aa1蛋白归类于Aerolysin型β穿孔蛋白家族中。同时,比较了Cry51Aa1蛋白单体三结构域与Aerolysin型β穿孔蛋白家族成员结构的异同。6.功能性实验初步表明,Cry51Aa1蛋白对马铃薯甲虫幼虫有较高的杀虫活性。对鞘翅目昆虫的活性实验验证了Cry51A类蛋白的杀虫谱,使之成为结构新颖、且对鞘翅目有特异性杀虫活性的一类苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白;对冈比亚按蚊幼虫细胞系的毒性测定发现,经酶解Cry51Aa1蛋白处理的细胞出现气球样变的现象,说明蛋白能影响细胞膜的完整性,即活化后的Cry51Aa1蛋白具有溶细胞活性。本研究利用结构生物学研究手段,摸索并提炼出了一套适用于苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白表达体系的蛋白纯化、结晶、X射线衍射、结构解析的完整技术路线。结构新颖的Cry51Aa1杀虫晶体蛋白为苏云金芽胞杆菌结构生物学的研究增添了新的成员,也提供了新的研究思路;功能性结果验证并拓宽了Cry51Aa类蛋白的功能范围,不仅证实了Cry51A类蛋白与鞘翅目和半翅目昆虫细胞膜之间存在特异的相互作用,也暗示了该类蛋白在昆虫细胞膜上的作用方式可能与Aerolsyin型β穿孔蛋白家族类似。对Cry51Aa1杀虫晶体蛋白结构的深入研究和分析,为今后进一步阐明Cry51A类蛋白结构与功能的关系、作用机理的研究,以及害虫生物防治奠定了一定的基础。本文在阐述Cry51Aa1杀虫晶体蛋白结构及功能研究之前,对目前苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白结构与功能的研究进展情况作了一个较为详尽的综述。综述着力分析、归纳和总结了苏云金芽胞杆菌三类不同结构特征晶体蛋白的特点;比较分析了相似蛋白结构与相应功能的异同;探索了杀虫晶体蛋白的作用机制,为Cry51Aa1蛋白结构与功能的研究提供了思路和经验。同时,为凸显现代结构生物学的特点,本论文对蛋白质的X射线晶体学基本概念与研究方法也进行了简要概述。