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目的:人类基因组约有40-50%的序列属于重复DNA序列,长散在核元件(long interspersed nuclear elements,LINEs)是其中重要的一种类型。LINEs包括LINE-1(L1)和LINE-2(L2),前者占据了人类基因组的16.9%。基因组中的L1多数为不完整序列,且大多数L1重复序列在人类基因中以反序形式存在。IL-2基因,T细胞受体基因侧翼含有丰富的L1序列。因为L1在基因组中多数呈不完整片断分布,所以有必要研究L1片段对基因表达的影响。L1-ORF2(L1重复序列第2读码框)按正序方向插入pEGFP-C1(C1)质粒的GFP基因下游,强烈抑制GFP基因表达,反序方向插入则导致GFP转录提前终止,但并不清楚L1-ORF2的这种特性是其整体特征还是由个别片段造成。为了研究L1-ORF2不同片段对上游基因的影响,将来自Xq13.1位置的L1-ORF2(L1PA3家族)不同位置片段(各280bp)及Alu元件(283bp)的8串联体,分别按正、反序方向插入C1质粒,瞬时转染HeLa细胞,Northern杂交和荧光显微镜检测下游序列对GFP基因表达的影响。富含“A”碱基是L1-ORF2的序列特点,“A”碱基含量为40.89%,为了研究富含“A”碱基的简单重复序列是否有正、反序列影响GFP基因表达不同的特征,将736bp的(AAACAAA)n或(AG)n按正、反方向插入C1质粒,观察简单重复序列对GFP基因表达的影响。方法:1重组质粒构建设计5对带合适酶切位点的引物(Table 1),用RP11-29107克隆作模板,分别扩增5段L1-ORF2片段(各280bp)。PCR扩增片段与C1质粒经酶切和T4 DNA连接酶连接,获得5种插入一个片段的重组质粒。XbaⅠ和NheⅠ的粘性末端可以用T4 DNA连接酶连接,但是连接后不被XbaⅠ和/或NheⅠ切断,利用该特性反复同向串联构建出含8串联片段的重组质粒。将8串联重组质粒插入片段反向插入,筛选出反序重组质粒。构建缺失3’端序列的ORF2(3212bp)片段反向插入表达载体,命名为p280-1~8as。合成上游带有EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点,下游带有NheⅠ和KpnⅠ酶切位点,中间分别带有AAACAAA或AG简单重复序列的寡核苷酸,引物扩增使其成双链,扩增片段与C1质粒经酶切后连接,串联重复,获得含有正、反序简单重复序列( 736bp )的重组质粒,命名为p(AAACAAA)Rep , p(AAACAAA)Repas , p(AG)Rep ,p(AG)Repas。2细胞转染将构建成功的重组质粒和C1质粒分别以脂质体法转染HeLa细胞,37℃、5% CO2环境培养36小时,12孔板细胞用于提取RNA,24孔板细胞用于荧光观察。3 Northern杂交用Trizol提取质粒转染的HeLa细胞总RNA,甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,毛细法将RNA转移到尼龙膜。α-32P标记的GFP探针杂交、冲洗后放射自显影。尼龙膜用剥离液处理,冲洗后用检测Neo (neomycin resistance cassette) RNA的探针再次杂交,作为对照。4荧光阳性细胞计数转染质粒的HeLa细胞经4%多聚甲醛固定,×100倍视野白光下计数细胞总数,同样视野紫兰光下计数荧光阳性细胞数,计算荧光细胞阳性率。结果:1重组质粒1.1重组质粒构建构建以下18种重组质粒: p280-1*8as,p280-2*8,p280-2*8as,p280-4*8as,p280-5*8,p280-5*8as,p280-7*8,p280-7*8as,p280-8*8,p280-8*8as, p280-9*8 , p280-9*8as , pAlu*8as , p280-1~8as ,p(AAACAAA)Rep , p(AAACAAA)Repas , p(AG)Rep , p(AG)Repas。经酶切(Fig.2,Fig.4),PCR(Fig.3,Fig.4),测序(Fig.5,Fig.6,Fig.7)鉴定正确。1.2其它重组质粒p280-1*8、p280-4*8、pAlu*8、pORF2及pORF2as为本研究室其它工作构建。本研究所使用的全部质粒及说明见Table 2。2 L1-ORF2不同串联片段和Alu串联序列对GFP报告基因表达的影响2.1 Northern杂交分别用L1-ORF2串联片段和Alu串联正、反序重组质粒转染HeLa细胞,提取总RNA,Northern杂交,结果(Fig.8)显示所有L1-ORF2串联片段中反序GFP基因的表达均高于正序, Alu与L1-ORF2片段不同,正序的GFP基因表达高于反序;不同串联片段转录终止位置不同,p280-1*8、p280-5*8、p280-9*8、p280-1*8as及p280-9*8as发生转录提前终止。2.2荧光阳性细胞计数选择p280-1*8、p280-5*8、p280-9*8及相应的反序分别转染HeLa细胞做荧光显微镜观察(Fig.9),荧光细胞阳性率均值(±SD)分别为:p280-1*8(1.81±0.87)% , p280-1*8as(14±4.63)% ,p280-5*8(0.51±0.17)% , p280-5*8as(12.5±3.04)% ,p280-9*8(2.54±0.59)%,p280-9*8as(11.96±4.54)%。3 L1-ORF2去除3’端序列后反向插入不发生GFP基因转录提前终止3.1 Northern杂交L1-ORF2反序插入C1质粒(pORF2as)出现转录提前终止。去除L1-ORF2 3’端序列的反序重组质粒(p280-1~8as)与pORF2as不同,不发生转录提前终止,而是出现转录延伸条带的量高于提前终止性条带(Fig.10)。3.2荧光阳性细胞计数pORF2, pORF2-1~8as及pORF2as分别转染HeLa细胞做荧光显微镜观察(Fig.11),荧光细胞阳性率分别为: pORF2(0.16±0.03)% , pORF2-1~8as (3.93±0.25)%,pORFas(5.45±1.00)%。4简单重复序列对GFP报告基因表达的影响4.1 Northern杂交插入AAACAAA或AG简单重复序列反序的GFP基因转录强度分别高于其正序,且AAACAAA正、反序插入均发生GFP基因转录提前终止(Fig.12)。4.2荧光阳性细胞计数p(AAACAAA)Rep, p(AAACAAA)Repas, p(AG)Rep,p(AG)Repas及C1质粒分别转染到HeLa细胞做荧光显微镜观察(Fig.13),荧光细胞阳性率分别为: p(AAACAAA)Rep(2.86±0.25)% ,p(AAACAAA)Repas(5.71±0.41)%,p(AG)Rep(2.23±0.47)%,p(AG)Repas(2.86±0.34)%,pEGFP-C1(39±3.67)%。结论: 1所有pEGFP-C1下游插入的序列均抑制GFP基因表达,但是抑制程度和转录终止位置不同。2 L1-ORF2反序出现提前终止,去除L1-ORF2的3’端序列的反序片段不再出现转录提前终止,说明L1-ORF2反序导致的GFP基因转录提前终止是由L1-ORF2的3’端部分序列决定的。3插入AAACAAA、AG简单重复序列反序的GFP基因转录强度高于其正序,说明简单序列在ORF2正、反序影响GFP基因表达特征上起作用。AAACAAA正、反序均引起GFP转录提前终止,说明短的简单重复序列也能调节GFP基因转录终止。