论文部分内容阅读
细胞因子是由造血系统、免疫系统所产生的一类高活性、多功能的蛋白质或多肽，通过调节其相应靶细胞的增殖、分化及其靶细胞介导的生物学效应过程参与了机体内造血调控、免疫应答等生理及病理过程。细胞因子的融合蛋白(cytokine fusion protein) 是当今免疫学研究的一个热点问题。凭借基因工程技术构建的细胞因子间融合蛋白，既具有其组成因子的独特的生物学活性，还有可能会通过生物学活性的互补及协同效应发挥出较单一细胞因子更佳的生物学活性。迄今为止，国内外学者都已经在该方面开展了深入的研究，构建了多种融合蛋白，其中一些细胞因子融合蛋白如GM-CSF/IL-3融合蛋白因为表现出较好的生物学功能而显现出了诱人的临床应用前景。(型巨噬细胞炎性蛋白MIP-2( (macrophage inflammatory protein-2 gammar)是本室从人树突状细胞（DC）cDNA文库中克隆到的一个新的不含ELR基序的CXC类趋化因子。本室以往的研究工作初步证明，该新型趋化因子不仅对中性粒细胞、树突状细胞等造血与免疫细胞具有趋化作用，而且还具有一定的造血调控活性。体外克隆形成实验表明，该新型趋化因子可与多种造血生长因子协同，促进髓系及巨核系前体细胞的增殖及分化。GM-CSF是目前已知的一种具有广泛生物学活性的造血生长因子，可以刺激粒系及单核系造血前体的增殖及分化，促进中性粒细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性粒细胞及单核巨噬细胞的生成，并能增强中性粒细胞及巨噬细胞的吞噬及杀伤功能。而且最近的研究结果表明，GM-CSF可促进树突状细胞的成熟，增强树突状细胞的抗原提呈功能，在临床上可以用于感染性疾病及恶性肿瘤的免疫治疗。可见MIP-2(与GM-CSF的生物学功能具有一定的互补性，若将两者结合在一起制成具有两者各自生物学活性的融合蛋白，该融合蛋白可能会发挥先将免疫和造血细胞"趋化和聚集",然后再进行"激活和增强"这些免疫、造血细胞的功能,推测该融合蛋白可能会具有比单一细胞因子更好的生物学功能，有望成为一种在造血调控及抗肿瘤免疫中具有更佳生物学活性的新型细胞因子。本研究通过基因工程方法构建了携带MIP-2(与GM-CSF基因的真核表达载体，通过转染COS-7细胞，瞬时表达MIP-2(/GM-CSF融合蛋白,收集含融合蛋白基因的细胞培养上清，并在体外实验中证实了该融合蛋白具有较好的造血促进作<WP=6>用及趋化活性。首先我们将人MIP-2γ基因与真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A连接而构建了人MIP-2γ基因表达载体，利用pcDNA3.1/myc-His(-) A载体中947-983bp序列编码的一段能灵活伸展的12肽作为连接肽，将人和小鼠的GM-CSF基因分别连接到pcDNA3.1/myc-His(-)A- MIP-2γ质粒载体上，从而分别构建了人MIP-2γ/人GM-CSF、人MIP-2γ/小鼠GM-CSF融合基因表达载体。NheⅠ、HindⅢ双酶切鉴定和DNA测序鉴定表明2个融合蛋白表达载体均构建正确。然后我们用人MIP-2γ/人GM-CSF表达载体通过脂质体法瞬时转染COS-7细胞，培养48小时,收集含目的融合蛋白的细胞培养上清。采用抗人GM-CSF单克隆抗体对上述培养上清进行Western blot鉴定，发现在28KD处有一明显的阳性条带，表明我们已成功地通过瞬时表达体系获得了所需的融合蛋白。进一步以人GM-CSF的ELISA检测试剂盒定量检定培养上清中GM-CSF水平，结果表明，COS-7细胞瞬时表达上清中人GM-CSF的含量为6.8ng/ml,据融合蛋白中MIP-2(与GM-CSF的分子量和摩尔数之比算得MIP-2(/GM-CSF融合蛋白含量约为10.4 ng/ml。随后，我们开展了对上述MIP-2(/GM-CSF融合蛋白的体外生物学功能的研究。首先我们用对人GM-CSF依赖的Mo-7e细胞株检定了培养上清Mo-7e细胞的促增殖作用。MTT法检测的结果表明，含目的融合蛋白的上清能显著刺激Mo-7e细胞的增殖，其比活性达10.2IU/ng，与人GM-CSF标准品相当。然后我们观察了融合蛋白在体外半固体培养体系中对人骨髓细胞集落形成的的促进作用，采用造血干/祖细胞的甲基纤维素培养试剂盒,培养14天,结果显示在培养体系中的融合蛋白可显著刺激骨髓细胞的集落生成。表明所表达的MIP-2(/GM-CSF融合蛋白具有良好的与GM-CSF相似的造血促进作用。利用Transwell趋化活性检测体系，我们进一步研究了上述融合蛋白对多种免疫活性细胞的体外趋化作用。结果表明融合蛋白与MIP-2γ相类似，能趋化未成熟树突状细胞(由CD34+造血干/祖细胞来源的，培养第7天的CD34-DC-7d)，而且在MIP-2γ分子含量相当的情况下,融合蛋白的趋化能力强于MIP-2γ；而两者几乎都不能趋化成熟树突状细胞(培养第11天的CD34-DC-11d)。与MIP-2γ不同，含5.1ng/ml融合蛋白(相当于MIP-2γ1.8ng/ml)的培养上清即可以趋化未经活化的<WP=7>CD3+T淋巴细胞，趋化率为9.39%。而MIP-2γ却无此趋化效应。表明MIP-2(/GM-CSF融合蛋白具有比MIP-2(更广泛的趋化活性。综上所述，通过本研究我们成功地构建了携带人MIP-2γ与人GM-CSF融合蛋白基因的真核表达体系，通过转染COS-7细胞获得含融合蛋白的培养上清，并在体外实验中得到初步证实，该融合蛋白同时具有GM-CSF及MIP-2(的生物学活性，与GM-CSF相似，融合蛋白能促进造血细胞增殖；与MIP-2(类似，融合蛋白能趋化未成熟树突状细胞，且在MIP-2(含量相