一、研究背景 白癜风是一种由于黑素细胞(melanocyte，MC)特发性损害而致色素脱失的获得性皮肤病，病因不明，治疗较困难。 白癜风的病因及发病机制迄今尚未完全清楚，主要有自身免疫学说、黑素细胞自毁学说、神经化学因子学说、遗传学说等。近年有人提出微环境学说，认为表皮微环境变化参与白癜风的发病。体外研究证实微环境中最重要的细胞——角质形成细胞(keratinocyte，KC)对MC的生K分化有重要作用，KC和MC在表皮内互为比邻，解剖关系密切，是近几年研究白癜风发病机理以及治疗的热点之一。KC可分泌一些对MC有重要影响作用的细胞因子如碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、干细胞因子(stem cell factor，SCF)、内皮素-1(endothelin-1，ET-1)、α-促黑素(α—melanocyte—stimulating hormone，α—MSH)、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、一氧化氮等，它们以旁分泌的方式调节MC的形态和功能；体外实验已证明KC与MC混合培养能明显促进MC生长，两者之间的直接接触被认为在黑素形成的调控中起着重要的作用；此外，KC外基质在MC增殖分化及轴突形成中扮演着重要的角色。KC分泌的上述因子中，bFGF是第一个被发现的能刺激黑素合成的KC源性的细胞因子，也是最重要的MC自然促分裂因子，天然丝裂原，在MC生长微环境中有着重要的意义，它能促进MC增殖、分化，还可以刺激皮损外的MC及毛囊外毛根鞘无色素黑素细胞的迁移。目前白癜风的治疗大概可以分为外科疗法和非外科疗法。 外科疗法分组织移植和细胞移植两种，前者易形成鹅卵石样外改变或形成疤痕，并可能发生同形反应及感染。细胞移植需要实验室专业技术知识，花费大，不能用于常规治疗。另外，由于一些MC的生长因子有致癌性以及受皮区移植后要进行紫外线的照射治疗，可能具有潜在的致癌危险。 药物治疗方面主要有激素类药物、免疫抑制剂、免疫调节剂、人胎盘提取液、地蒽酚、卡泊三醇、补充微量元素、中药等等。但药物治疗的效果都有不尽如人意的地方，如副作用大，起效慢、疗效不显著等等。 光疗应用逐渐普遍，能取得比较好的效果，已成为治疗白癜风公认的最有效的方法。它可通过多方面的作用促进色素恢复，因而起效比较快，更容易保持住色素沉着。光疗主要包括光化学治疗、311nm窄波中波紫外线(narrow-band ultraviolet B，NB-UVB)及308nm准分子激光等。其中光化学治疗容易出现不同程度的光毒反应或肝肾功能损害，还可能有远期的致癌作用。NB-UVB与光化学治疗相比，疗效相当，光毒性小，治疗时间更短。但由于非选择性照射皮肤，累积剂量高，也有潜在的致癌作用。 308nm准分子激光(308nm excimer laser)是近十年开始应用于皮肤病的一种新型紫外线，它光谱窄，纯度高，穿透力强，红斑效应相对较小，副作用少，而且避开了DNA的吸收高峰，故不易引起DNA突变，致癌性降低。国外已有较多的临床研究证实它作为白癜风治疗的一种新手段，具有见效快、疗程短、不良反应少等特点，尤其适用于受累面积<30％的稳定型者，在面颈部及躯干部位的治疗中见效尤为明显。国内近几年也陆续见临床应用上的报道，同样取得了很好的疗效。308nm准分子激光已成为白癜风光疗的最佳选择。 然而，至目前为止，关于308nm准分子激光治疗白癜风作用机制方面的研究仅有个案报道。认为该激光治疗白癜风的机制为刺激MC的增殖和迁移、增加黑素的合成，诱导T细胞调亡，诱导细胞因子分泌及炎症介质IL-1、TNF-α、白三烯C4释放等等。这些研究多着眼于免疫学方面与MC本身，关于MC生长微环境中最重要的成分——KC及其分泌的因子发生了什么变化尚未有报道。基于上述所提到的KC分泌的bFGF对MC的重要性，我们的实验对308nm准分子激光照射后KC细胞活力及其产生的bFGF的mRNA表达水平以及分泌水平进行研究，并同时与对白癜风也有肯定疗效的NB-UVB进行对比性研究，从而为临床治疗提供理论上的依据。 二、研究目的 1.探讨308nm准分子激光对人KC活力的影响； 2.探讨308nm准分子激光照射前后KC bFGF mRNA表达水平与分泌水平的变化； 3.与311nm窄波中波紫外线进行比较，探讨两种光源的差别。 三、实验对象与方法 1.标本来源：我院外科门诊包皮环切术的健康包皮，16≤年龄≤30岁，标本切取后立即放入含有抗生素(20ug/ml庆大霉素)的PBS中，4℃中保存，当天进行KC的体外培养。 2.细胞培养和观察：将皮肤标本修剪后用消化液消化分离得到表皮，制成表皮单细胞悬液，接种于限制性角质形成细胞培养基。每天在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，待细胞长到约80％满时，进行消化、传代。取第2或第3代细胞分组后予不同剂量的308nm准分子激光和NB-UVB进行照射，并设对照组不照射。 3.细胞活力测定：细胞传代接种至96孔培养板中，细胞生长至融合50％左右，分别予以两种不同光源不同剂量：100、200、300、400、500、600mj/cm2进行照射，对照组不照射。24h后用MTT法测定细胞活力。 4.bFGF表达水平、分泌水平的测定： 1)细胞传代进行24孔培养板，细胞生长至60～70％进行308nm准分子激光、NB-UVB照射；24h后上清液离心后-80℃保存用于测定bFGF分泌水平，细胞用于测定bFGFmRNA表达水平。 2)用哺乳动物RNA抽提方法，提取各个剂量组细胞的总RNA，用紫外分光光度计分别测定并计算所提RNA的OD260/OD280，比值，检验其纯度并计算RNA浓度。RNA水溶液进行琼脂糖凝胶电泳，检测其完整性。 3)参照逆转录试剂盒说明进行操作合成cDNA，于-20℃保存备用。 4)cDNA进行多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，产物琼脂糖凝胶电泳并摄像，所得电泳图像用凝胶成像分析软什对PCR产物电泳图像进行分析。 5)上述细胞上清液按照商品化的ELISA试剂盒分别检测照射组与对照组bFGF分泌水平。 5.统计学处理：细胞活力、不同照射剂量的实验组与对照组bFGF表达水平、分泌水平采用随机区组方差分析(ANOVA)，同一剂量不同光源之间采用单因素方差分析。P<0.05有统计学意义。 四、结果 1. 308nm准分子激光和NB-UVB照射后都表现为：100、200、300、400mj/cm2剂量照射细胞活力与对照组相比无明显改变。500 mj/cm2的剂量照射308nm准分子激光对细胞活力没有影响，而311nm窄波紫外线细胞活力下降，两种光源600mj/cm2剂量照射与对照组相比细胞活力都下降。 2. 308nm准分子激光和NB．UVB在100、200、400 mj/cm2剂量照射后bFGFmRNA表达水平都比对照组要高，且在照射剂量范围内随剂量增大而增高。但同一剂量的308nm准分子激光和NB-UVB照射bFGFmRNA表达没有差别。 3.308nm准分子激光和NB-UVB 100、200、400 mj/cm2照射后KC bFGF分泌水平都比对照组要高，且在照射剂量范围内随剂量增大而增高。两种光源予100 mj/cm2照射后KC bFGF分泌水平没有差别，而予308nm准分子激光200、400 mj/cm2照射剂量下KC bFGF的分泌水平要比同等剂量NB—UVB照射要高。 五、结论 1. 100～500 mj/cmz剂量的308 nm准分子激光照射对KC的细胞活力没有影响，超过500 mj/cm2会造成KC损伤无法恢复，从而影响细胞活力。KC对308nm准分子激光有比较高的耐受性。 2.308nm准分子激光在实验剂量范围内能促进KC表达、分泌bFGF，且随照射剂量的增加而增加。表明它能通过促进KC表达、分泌bFGF达到促进黑素细胞增殖、迁移、黑素合成增多的可能。这可能308nm准分子激光是治疗白癜风的作用机制之一，为临床应用提供了理论依据。 3.通过与NB-UVB照射后KC活力及bFGF表达分泌水平的比较，认为①KC对308nm准分子激光的耐受性比对NB—UVB的要高，允许较高剂量的308nm准分子激光照射，从而提高治疗效果；②308nm准分子激光更能在蛋白水平上促进bFGF的增加，308nm准分子激光促进MC增殖、分化与迁移等的作用更强，从而使白癜风皮损得以恢复，取得更好的临床效果。