论文部分内容阅读
骨骼系统是体内的主要承重器官,对力学环境的变化十分敏感,而且重力作为维持骨组织代谢平衡的重要作用力,在维持骨重建平衡中起重要作用。目前为止,MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约22 nt的内源性非编码小 RNA分子,它能够通过与靶基因的mRNA的3’非翻译区(3′UTR)结合,从而抑制靶基因的翻译或降解靶基因。miRNAs参与早期发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化等复杂的生物学过程。miR-138作为一种 miRNA,可通过精密调控其靶基因表达,参与细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化等生物学过程。miR-138家族包括miR-138,miR-138-1,miR-138-2,miR-138-5p与miR-138-3p等,miR-138-5p、miR-138-3p依据其来源于pre-miR-138的5’端臂或3’端臂而得名。越来越多的研究证明 miR-138-5p在成骨细胞分化和骨形成中起了重要的调节作用,但是其在骨组织感知与响应力学刺激中的作用及机制目前还没有研究报道。本论文目的是采用后肢去负荷(HLU)小鼠模型,筛选对力学去负荷型骨质疏松敏感 miRNAs,然后对获得的力学去负荷敏感 miR-138-5p进行功能验证,最后从分子和细胞水平研究 miR-138-5p参与力学去负荷型骨质疏松发生机制。 本研究首先重建了 HLU小鼠模型。选用 Balb/c小鼠,尾悬吊28天后处死小鼠。取股骨采用MicroCT扫描;提取承重骨骨组织RNA样品提取。其次从文献报道的与成骨骨性形成相关的miRNAs,并结合 TargetScan,miRBase和 miRCode等数据库预测,筛选与骨形成相关的候选 miRNAs,设计引物并采用 qPCR进行验证。并对获得的候选 mir-138-5p进行靶基因预测。再次,针对获得的力学去负荷敏感miR-138-5p,设计antagomir-138-5p并转染至成骨细胞 MC3T3-E1。采用茜素红染色法检测成骨细胞形成矿化结节的变化;利用 BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒对细胞进行染色,检测 ALP活性变化。最后,利用Real time PCR和Western blot方法检测RPM培养条件对miR-138-5p、骨形成标志物、miR-138-5p靶基因微管微丝交联因子(MACF1)表达的影响以及 antagomir-138-5p对RPM效应的逆转。 主要结果: 1.重建了HLU小鼠模型 与对照组相比,HLU组的体重明显下降,然而血液中和尿中的Ca+浓度却明显升高。MicroCT分析股骨远端,发现与对照组相比,HLU组骨形成的相关参数如骨矿物质含量(BMC)、骨密度(BMD)、组织骨密度(TMD)骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th.)、骨小梁数量(Tb.N.)等明显下降,而骨小梁分离度(Tb.Sp.)明显升高。所有的结果显示后肢去负荷会导致骨丢失。 2.获得了6条对力学去负荷敏感miRNAs 利用生物信息学方法,在已发表的文献中,筛选出30条参与骨形成过程的miRNAs,在HLU小鼠模型中,利用qPCR筛选出14条表达差异的miRNAs,根据ct值的稳定性,筛选出六条比较好的miRNAs:miR-138-5p,miR-200a-3p,miR210-3p,miR-208a-5p,miR-2861 and miR-125a-3p。利用TargetScan,miRBase和miRCode等数据库分析筛选得到的六条 miRNAs的靶基因,发现大部分 miRNAs靶向微丝微管交联因子1(MACF1)。六条miRNAs中,miR-138-5p对去负荷力学响应变化最大,而且目前在骨中的研究比较少,故选择 miR-138-5p研究 miRNAs在骨组织力学去负荷刺激改变下的调节机制。多个数据库显示MACF1是miR-138-5p的靶基因之一。 3. miR-138-5p抑制了成骨细胞分化及矿化 qPCR结果发现 antagomir-138-5p转染成骨细胞 MC3T3-E1后,miR-138-5p明显下降,miR-138-5p的靶基因 MACF1以及成骨标记基因碱性磷酸酶(ALP)、I型胶原(ColI)均显著升高。Antagomir-138-5p转染成骨细胞 MC3T3-E1后24天,采用茜素红染色法发现成骨细胞形成矿化结节明显增加,而且 Image J软件分析矿化结节面积也显著升高。Antagomir-138-5p转染成骨细胞MC3T3-E1后48h,利用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒对细胞进行染色,发现 ALP活性明显升高,并采用 Image J软件分析染色面积也显著升高。 4. Antagomir-138-5p逆转了RPM对成骨细胞以及miR-138-5p表达的影响 Antagomir-138-5p转染成骨细胞 MC3T3-E1,并采用三维随机回转仪(RPM)条件处理,qPCR结果显示 antagomir-138-5p处理组与对照组相比,miR-138-5p明显下降,miR-138-5p的靶基因MACF1以及成骨标记基因碱性磷酸酶(ALP)、I型胶原(ColI)均显著升高。而与对照组(不做任何处理)相比均无明显变化。 综上所述,在力学去负荷条件(HLU和RPM)下miR-138-5p的表达明显升高,成骨细胞分化能力降低,而 antagomir-138-5p能有效地逆转力学去负荷对成骨细胞分化的抑制作用。miR-138-5p通过抑制其靶分子MACF1的表达,参与成骨细胞分化和骨形成过程。miR-138-5p是一种力学去负荷敏感的miRNA分子,可能成为治疗骨质疏松疾病的一个新的靶点。