背景和目的本课题是结合临床检验诊断学,危重病医学和外科学等多学科共同合作进行的临床相关疾病的分子机制研究。本课题的主要研究在危重病医学方面,即远端器官致肺损伤的基础和临床研究。而临床相关疾病为肝肺综合征(hepatopulmonary syndrome,HPS),研究其病理生理的分子调控机制。同时结合临床检验诊断学,利用固相指数扩增反应(solidoid exponential amplification reaction,sEXPAR)-表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)生物传感器技术作为筛选工具,对HPS进程相关的关键调控蛋白的转录后调控靶点进行筛选,这种技术具有高效、高通量的优点。筛选结果再结合文献及前期实验,可以使研究具有指向性和可操作性,进一步揭示HPS的病理生理机制。HPS是一种晚期肝病导致肺内微血管发生一系列病理变化的临床综合征。HPS的发生率在肝病晚期的患者中已经大于15%,并且其死亡率呈现增长趋向,因此对HPS的病理生理机制的研究具有重要意义并逐渐成为热点。肺组织中的肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs)受到循环中来自肝脏的刺激因素的作用,使它们发生肌样分化并增殖异常导致肺内微血管扩张(intrapulmonary vasodilatation,IPVD),肺内氧合障碍形成的低氧环境进一步促使血管中层的肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)出现表型转换并增殖加剧,这些均加重肺血管重建(pulmonary vascular remodelling,PVR),最终促使HPS的发生发展。因此,HPS相关的PVR中包括PMVECs和PASMCs两种主要细胞的分化,表型转换和异常增殖等。本课题主要针对PASMCs发生病理生理变化的分子调控机制进行研究。既往研究报道,在HPS的病理进程中,多种细胞因子进入循环,激活多条信号通路,导致PASMCs发生表型转换和异常增殖。这些信号通路彼此交错,错综复杂,难以完全阻断,研究需要进一步深入。近年对于PASMCs炎症表型介导机制的研究发现,在低氧性肺动脉高压等的病理条件下,低氧等刺激因素和多种生长因子可以介导PASMCs的炎症表型。HPS的发生发展中多种细胞炎症介质释放,而血管收缩和氧合障碍也进一步加重IL-1、IL-6和前列腺素E2(PGE2)等炎性介质的释放。PASMCs发生炎症表型,并从G0/G1期重新进入细胞周期,从静止转化为增殖状态。因此PASMCs炎症表型的变化可能是其发生其他病理生理变化的前提。基于以上原因,本课题选择对PVR相关的PASMCs的炎症表型和增殖的调控机制进行研究,以期为HPS找到新的基因治疗靶点。sEXPAR-SPR生物传感器检测技术,是结合s EXPAR和SPR的新型检测技术。SPR生物传感器是基于光学物理原理的检测技术,通过在芯片检测池或其表面结合生物大分子以及利用这些生物大分子的相互作用可改变其折射率,从而实现生物大分子的快速、准确、灵敏、简便的检测。s EXPAR是一种DNA恒温指数扩增的方法,通过形成聚合-置换-切开-聚合的循环,从而实现恒温指数扩增。通过两种技术的结合,针对检测目标DNA设计引物及探针,实现对目标DNA的s EXPAR。而SPR的同一芯片不同检测池可以固定不同探针,从而实现对目标DNA的高通量、快速、准确、灵敏的检测。微小RNA(miRNA)是约20~24个核苷酸长度的非常保守的单链非编码小RNA。越来越多的文献表明,miRNA可以作为新的靶点用于疾病的早期诊断或治疗。在本研究中,我们拟采用s EXPAR-SPR生物传感器这一技术对HPS相关的PVR中mi RNA的表达进行高通量、高灵敏度的筛查。检测阳性的mi RNA结果,其对应调控的靶蛋白可能成为在PASMCs炎症表型及增殖中具有重要调控作用的潜在蛋白。膜联蛋白A1(Annexin A1,ANXA1)是膜联蛋白家族成员之一,是钙离子依赖的细胞膜磷脂结合蛋白。ANXA1在不同的组织和部位发挥着包括抗炎效应,介导细胞信号转导等多种生物学功能。通过sEXPAR-SPR生物传感器技术的筛选,我们发现miR-30a-5p在HPS组中表达明显上调并具有统计学意义,而通过预测发现其可以通过转录后调控机制调节ANXA1的表达。结合既往研究和我们前期的实验结果,推测ANXA1可能参与HPS相关的PASMCs炎症表型和增殖的调控。同时由于HPS大鼠肺组织病理变化,以及结合既往的研究结果,课题组同时选择和血管重构及肺动脉高压等疾病关系紧密的内皮素-1(endothelin-1,ET-1)进行相关机制的进一步探索,对ET-1的研究可能有助于进一步完善ANXA1在HPS相关PVR的分子机制的研究。方法1.EXPAR反应体系的建立和条件的优化,通过55.0℃-65.0℃的温度梯度,采用荧光定量方法(实时荧光EXPAR),探索EXPAR的适宜条件;制作SPR相关探针,处理SPR生物传感器基质膜芯片,并进行探针的固定,通过传感器实时检测SPR角度,最终建立s EXPAR-SPR生物传感器技术;2.通过CBDL法建立在体HPS动物模型,根据通用标准判断模型建立成功;利用s EXPAR-SPR生物传感器技术检测HPS大鼠肺组织中系列miRNA的表达变化;对于表达变化有统计学差异的结果,通过http://www.mirbase.org/网站进行调控mRNA靶基因的预测;3.结合sEXPAR-SPR生物传感器技术检测结果和既往研究,选取ANXA1作为研究靶蛋白,应用免疫组化和Western-blot法检测HPS相关模型中ANXA1的表达变化;为完善ANXA1的相关研究,同时选取ET-1,检测其在HPS相关模型中的表达变化;4.对ANXA1进行干预作为可变因素,即利用腺病毒转染上调PASMCs中ANXA1蛋白转录和表达水平,并采用RT-PCR、Western-blot法及免疫荧光等方法,检测转染效率;5.通过腺病毒转染上调ANXA1的表达,同时再复合ET-1预处理,利用ELISA法检测各组中IL-1β,TNF-α和IL-6的释放;同时利用CCK-8、3H-TdR及Western-blot法检测PASMCs的增殖情况及增殖相关蛋白p-ERK1/2和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的生成和表达;6.利用RT-PCR和Western-blot法,检测ET-I预处理的PASMCs细胞中ANXA1的转录和表达水平;利用ROS检测技术检测ET-1对PASMCs中ROS释放的影响;7.利用免疫共沉淀技术,检测ANXA1和羰基化ANXA1的生成情况;复合应用蛋白酶体抑制剂MG-132复合处理后,检测各组ANXA1的蛋白表达情况。结果1.EXPAR反应体系的建立,确定50℃为EXPAR的适宜条件;靶基因的浓度和EXPAR的曲线起跳时间及T50值呈线性相关,当浓度高时,曲线起跳早而T50值较低;当浓度低时,曲线起跳晚而T50值较高,确定液相EXPAR检测下限为100fM;目的基因和对照组进行探针的制备和固定,目的基因流池曲线呈指数式升高,形成约500毫度的SPR角度变化,空白对照无明显扩增反应。s EXPAR-SPR生物传感器实时在线检测,当待测DNA序列浓度为10-14M到10-8M时,T50与待测靶标浓度的对数(lgC)呈线性相关,最终sEXPAR-SPR生物传感器技术构建成功;2.sEXPAR-SPR生物传感器检测发现mi RNA-30a-5p在HPS组中T50值较对照组明显缩短(P<0.05),提示其在HPS组中表达上调。通过http://www.mirbase.org/网站预测,发现其可以转录后调控ANXA1;3.利用免疫组化和Western-blot法检测发现,HPS大鼠动物模型肺组织中ANXA1表达明显下调,ET-1表达明显上调;在PASMCs中ANXA1的表达随ET-1的增加,呈剂量依赖性减少;4.利用免疫荧光、RT-PCR及Western-blot法检测,AD-ANXA1腺病毒可以高效转染PASMCs(转染率>90%),细胞生长良好,AD-ANXA1组其ANXA1的m RNA及蛋白表达水平明显上调;5.通过ELISA法检测PASMCs中炎症因子的释放,AD-ANXA1转染可以明显抑制IL-1β,TNF-α和IL-6等炎症因子的释放;而ET-1预处理的PASMCs中炎症因子释放明显增加;6.通过CCK-8和3H-TdR法检测,AD-ANXA1转染可以明显抑制PASMCs的增殖;而ET-1预处理可以促进PASMCs的增殖;7.通过Western-blot法检测,AD-ANXA1转染可以明显抑制p-ERK1/2的生成和cyclin D1蛋白的表达;加入刺激因素ET-1后,p-ERK1/2生成及cyclin D1蛋白的表达明显上调;8.RT-PCR及Western-blot法检测,ET-1预处理的PASMCs中ANXA1的转录水平变化不明显,无论加或不加转录和翻译抑制剂Act-D和CHX,其蛋白表达的减少都非常近似;9.ROS检测发现,ET-1预处理的PASMCs中ROS产生显著增加;免疫共沉淀检测发现,ET-1预处理的PASMCs中羰基化ANXA1明显增加;10.利用蛋白酶体抑制剂MG-132复合处理后,ET-1诱导的ANXA1蛋白减少被明显抑制。结论1.sEXPAR-SPR生物传感器是一种高效、高通量的检测技术,待测基因的浓度和曲线起跳时间及T50值相关,这一技术可以作为HPS相关研究的初筛工具;2.在HPS肺组织中,mi R-30a-5p表达明显上调,通过预测发现其可以对ANXA1进行转录后调控,结合既往研究结果,推测ANXA1在HPS相关PVR中具有调控作用;3.在HPS相关模型中ANXA1和ET-1发生相应变化,且在PASMCs中ANXA1的表达随ET-1的增加,呈剂量依赖性减少。推测ET-1通过调控ANXA1的表达在HPS中发挥重要作用;4.利用腺病毒转染上调ANXA1的表达后,PASMCs中的炎症因子释放被显著抑制,ET-1的增加可能刺激炎症因子的释放,其作用可能是通过下调ANXA1表达而实现;5.AD-ANXA1转染PASMCs后,其增殖明显受抑,并且抑制p-ERK1/2的生成和从胞质转移至胞核,同时抑制cyclin D1蛋白的表达,而加入ET-1后可能刺激PASMCs的异常增殖和上调增殖相关蛋白的生成和表达,其作用可能是通过下调ANXA1表达而实现;6.ET-1不影响ANXA1的转录水平;其可能通过介导ROS的释放,使ANXA1发生羰基化并稳定性降低,发生了蛋白体酶相关的降解,最终导致ANXA1表达降低。通过以上结论提示,在HPS相关的PVR中,PASMCs发生炎症表型并异常增殖;ANXA1在HPS大鼠肺组织中表达下调,而ET-1表达上调;ET-1可能通过介导ROS的释放,使ANXA1发生羰基化并加剧降解,进而逆转ANXA1对PASMCs炎症表型和增殖的抑制,最终促进HPS相关PVR的进一步发展。