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脓毒症是一种由感染引起的炎症反应综合征,随着病情的加重,会发生多种器官功能障碍和衰竭,甚至会导致死亡。在我国,脓毒症不仅会给患者的家庭造成巨大的经济负担,而且是造成患者死亡的重要原因之一。目前针对脓毒症的治疗策略十分有限,治疗效果也不理想。因此,寻找治疗脓毒症的新靶点至关重要。干扰素诱导的跨膜转运蛋白3(IFITM3,interferon induced transmembrane protein 3)是一种广谱抗病毒蛋白,它参与了抗病毒感染的固有免疫、细胞粘附、炎症等多种生理过程的调节。近年来的研究显示,结核杆菌(MTb,mycobacterium tuberculosis)作用于TLR4后可以通过IFITM3调控溶酶体内的酸性环境抑制结核杆菌生长,提示IFITM3不仅参与了抗病毒过程的调节,可能在抑制细菌增殖方面也发挥着重要作用。另外,IFITM3 mRNA在精神分裂症患者中有异常表达,提示IFITM3与神经递质乙酰胆碱可能存在着一定的联系。在外周,胆碱能抗炎通路(CAP,cholinergic anti-inflammatory pathway)是脓毒症免疫调节的一条重要途径,乙酰胆碱作用于巨噬细胞表面的a7N型乙酰胆碱受体能够发挥抗炎、抗凋亡的作用,而IFITM3是否参与了胆碱能通路的调节仍未被研究过。本实验利用鼠源性巨噬细胞系(RAW264.7)探究了IFITM3与乙酰胆碱受体之间的关系,并且验证了IFITM3在胆碱能通路中抗炎和抗凋亡的作用,为下一步研究IFITM3的作用机制及脓毒症的治疗策略提供一些实验依据。研究目的在脓毒症模型上探究IFITM3与乙酰胆碱受体的关系,并验证IFITM3在胆碱能通路中抗炎和抗凋亡的作用。材料和方法第一部分实验1.将RAW264.7细胞分为2组:Control组和LPS组。LPS组给予1mg/ml LPS刺激,Control组给予生理盐水,分别在24 h、48 h、72 h收集细胞的蛋白样本,用Western Blot法检测各组IFITM3的蛋白表达水平。实验2.将RAW264.7细胞分为4组:Control组,LPS组,LPS+GTS-21组和LPS+GTS-21+a-BGT组。LPS+GTS-21组是胆碱能激动剂组,在给予1mg/ml LPS刺激24 h后给予50mM胆碱能受体激动剂GTS-21干预;LPS+GTS-21+a-BGT组是胆碱能拮抗剂组,在给予1mg/ml LPS刺激后12 h、24 h分别给予100 nM胆碱能受体拮抗剂a-BGT和50mM胆碱能受体激动剂GTS-21干预。48 h后收集细胞蛋白样本,用Western Blot法检测各组IFITM3的蛋白表达水平。第二部分实验1.将RAW264.7细胞分为4组:Control组,LPS组,LPS+GTS-21组和LPS+GTS-21+a-BGT组。干预方法同第一部分实验2,在给药后48 h用Elisa法检测各组细胞上清液TNF-a和IL-1b的水平。实验2.将RAW264.7细胞分为4组:Control组,LPS组,LPS+GTS-21组和LPS+GTS-21+a-BGT组。干预方法同上,在给药后48 h用比色法检测各组细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)的水平。实验3.将RAW264.7细胞分为4组:Control组,LPS组,LPS+GTS-21组和LPS+GTS-21+a-BGT组。干预方法同上,在给药后48 h用TUNEL法检测各组细胞凋亡的水平。第三部分实验1.将RAW264.7细胞分为9组:Control组(MOI=1),Control组(MOI=10),Control组(MOI=100),Virus组(MOI=1),Virus组(MOI=10),Virus组(MOI=100),Virus+Polybrene组(MOI=1),Virus+Polybrene组(MOI=10)和Virus+Polybrene组(MOI=100)。Control组给予生理盐水,Virus组给予抑制IFITM3表达的病毒,Virus+Polybrene组给予抑制IFITM3表达的病毒并同时给予感染增强剂。MOI=1,MOI=10,MOI=100是病毒与细胞的转染比例分别为1:1,10:1,100:1。转染后48 h后用荧光显微镜观察细胞的转染效果。实验2.将RAW264.7细胞分为4组:Negative组,shRNA-1组,shRNA-2组和shRNA-3组。Negative组给予IFITM3对照病毒,shRNA-1组,shRNA-2组和shRNA-3组分别给予构建了三种不同IFITM3 shRNA表达载体的病毒,转染48 h后用Western Blot法检测IFITM3的表达。实验3.将RAW264.7细胞分为4组:Control组,LPS组,LPS+GTS-21组,LPS+GTS-21+Lv-shIFITM3组。LPS+GTS-21组是胆碱能激动剂组,给予1mg/ml LPS刺激24 h后给予50mM胆碱能受体激动剂GTS-21干预;LPS+GTS-21+Lv-shIFITM3组是抑制IFITM3表达的胆碱能激动剂组,给予1mg/ml LPS刺激后24 h、48 h分别给予50mM胆碱能受体激动剂GTS-21和抑制IFITM3表达的病毒,72 h后用ELISA法检测各组TNF-a和IL-1b的水平。实验4.将RAW264.7细胞分为4组:Control组,LPS组,LPS+GTS-21组,LPS+GTS-21+Lv-shIFITM3组。分组方法同本部分实验3,72 h后用比色法检测各组LDH的水平。实验5.将RAW264.7细胞分为4组:Control组,LPS组,LPS+GTS-21组,LPS+GTS-21+Lv-shIFITM3组。分组方法同上,72 h后用TUNEL法检测各组细胞凋亡的水平。结果第一部分实验1.与对照组相比,LPS刺激24 h、48 h、72 h后,IFITM3蛋白表达明显降低(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。实验2.与对照组相比,LPS组IFITM3蛋白表达明显降低(P<0.001),与LPS组相比,LPS+GTS-21组IFITM3蛋白表达明显升高(P<0.001);而与LPS+GTS-21组相比,LPS+GTS-21+a-BGT组IFITM3蛋白表达明显降低(P<0.001)。第二部分实验1.与对照组相比,LPS组TNF-a和IL-1b水平明显升高(P<0.01,P<0.01);与LPS组相比,LPS+GTS-21组TNF-a和IL-1b水平明显降低(P<0.01,P<0.01);而与LPS+GTS-21组相比,LPS+GTS-21+a-BGT组TNF-a和IL-1b水平明显升高(P<0.01,P<0.01)。实验2.与对照组相比,LPS组LDH水平明显升高(P<0.05);与LPS组相比,LPS+GTS-21组LDH水平明显降低(P<0.05);而与LPS+GTS-21组相比,LPS+GTS-21+a-BGT组LDH水平明显升高(P<0.05)。实验3.与对照组相比,LPS组细胞凋亡水平明显升高(P<0.01);与LPS组相比,LPS+GTS-21组细胞凋亡水平明显降低(P<0.01);而与LPS+GTS-21组相比,LPS+GTS-21+a-BGT组细胞凋亡水平明显升高(P<0.01)。第三部分实验1.与其他组相比,Virus+Polybrene组(MOI=100)细胞转染病毒效率最佳。实验2.与Negative组相比,shRNA-1组,shRNA-2组和shRNA-3组IFITM3蛋白表达均明显降低(P<0.01,P<0.01,P<0.001)。实验3.与对照组相比,LPS组TNF-a和IL-1b水平明显升高(P<0.01,P<0.01);与LPS组相比,LPS+GTS-21组TNF-a和IL-1b水平明显降低(P<0.01,P<0.01);而与LPS+GTS-21组相比,LPS+GTS-21+Lv-shIFITM3组TNF-a和IL-1b水平并无明显差异(P>0.05,P>0.05)。实验4.与对照组相比,LPS组LDH水平明显升高(P<0.05);与LPS组相比,LPS+GTS-21组LDH水平明显降低(P<0.05);而与LPS+GTS-21组相比,LPS+GTS-21+Lv-shIFITM3组LDH水平明显升高(P<0.05)。实验5.与对照组相比,LPS组细胞凋亡水平明显升高(P<0.01);与LPS组相比,LPS+GTS-21组细胞凋亡水平明显降低(P<0.01);而与LPS+GTS-21组相比,LPS+GTS-21+shIFITM3组细胞凋亡水平明显升高(P<0.05)。结论我们的研究表明:刺激a7N型乙酰胆碱受体能够诱导IFITM3蛋白表达水平的升高,并且通过IFITM3发挥了抗凋亡的作用,但IFITM3并未参与这其中抗炎过程的调节。