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一、研究背景肿瘤细胞与微环境之间的相互作用越来越被认为是一个影响肿瘤恶性进展的重要因素,肿瘤细胞可以分泌一些生长因子和细胞因子激活细胞外基质,反过来,微环境提供的信号又促进肿瘤细胞侵袭和转移。目前研究认为,当肿瘤细胞存在于远处器官微血管系统时,它与血小板的聚集和微血栓的形成是密切相关的。一旦血小板被激活,血小板将释放特定生长因子,促进肿瘤转移形成。事实上,在许多试验中已经证实,在肿瘤发生血行转移过程中,血小板的作用是必不可少的。然而,肿瘤细胞与血小板相互作用的精确分子机制仍然是不清楚的。TN-C是一个复杂的多功能蛋白,它由一个N端tenascin适配区域,接着是14.5个类似表皮生长因子(EGF)重复结构域,可变的类似纤连蛋白III型(FN III)重复序列和C端类似纤连蛋白原的结构域组成。TN-C可以直接通过细胞表面受体或间接的结合其他基质蛋白影响肿瘤细胞行为,这将诱导血管生成和促进肿瘤细胞迁移。纤维性TN-C(fTN-C)主要表达于肿瘤细胞外基质(ECM),fTN-C基质的形成需要基质金属蛋白酶(MMPs)的参与,在促进肿瘤转移中可能发挥作用。MMPs是一群肽链内切酶,它能降解细胞外基质,调节ECM重塑。在以前的研究中已经证实,MMP-2和MMP-9的过表达可以极大的增强肿瘤的侵袭转移潜能。大多数研究表明,MMP-9和TN-C蛋白的过表达与肿瘤的进展和不良的预后是相关的,但MMP-9和TN-C在胰腺癌中的作用仍不清楚。血小板能促进肿瘤转移的形成,但是否是通过促进肿瘤细胞分泌MMP-9和TN-C来实现的,目前也是不清楚的。CD44是一种表达癌症表型的多功能细胞受体,CD44是一个单链,单程的跨膜糖蛋白,广泛表达于生理和病理系统。同时,CD44参与细胞粘附、肿瘤侵袭和转移。在以前的研究中,CD44已经被暗示能够以依赖透明质酸或不依赖透明质酸的方式调控基质金属蛋白酶的表达,主要是MMP-2和MMP-9。此外,在最近已有报道证实CD44在结肠癌细胞拥有selectin结合力,CD44是P-selectin配体。P-selectin是一个重要的粘附受体,表达于激活的内皮细胞上。与此同时,激活的血小板也表达P-selectin。所以我们可以假设肿瘤细胞与血小板之间的相互作用是通过cd44和p-selectin的粘附来完成的。因此,在这项研究中,我们调查tn-c和mmp-9在胰腺癌组织中的表达情况,分析mmp-9和tn-c表达和临床病理参数的相关性。与此同时,我们在肿瘤细胞与血小板共培养体系中研究人类胰腺癌细胞的侵袭能力。我们利用这个共培养系统,探测mmp-9和tn-c的表达水平。此外,我们进一步研究肿瘤细胞与血小板相互作用是否是通过cd44和p-selectin的结合来实现的。二、研究方法1.共收集了103例在第三军医大学西南医院肝胆外科研究所接受手术治疗的患者,从2007年1月至2010年6月的胰腺癌患者。所有患者接受根治性胰十二直肠切除术或保留幽门的胰十二直肠切除术,并做淋巴结清扫。没有一个病人接受了新辅助疗法和辅助放化疗。石蜡包埋切片样本用来做免疫组织化学分析。所有患者在术后3个月行超声波、放射x线及计算机断层扫描检查,探测到有新病变被认为是复发,平均随访期为13个月(范围3-49个月)。我们通过免疫组织化学的方法调查tn-c和mmp-9在胰腺癌组织的表达水平,分析单表达和共表达这两个分子和临床病理参数的相关性,并分析其与胰腺癌病人生存预后的相关性。2.人类胰腺癌细胞系aspc1和bxpc3。这些细胞系是购自美国atcc公司。这些细胞在含10%胎牛血清的rpmi1640或dmem培养基中培养,他们被保持在37°c的含有5%的二氧化碳环境中。与血小板共培养体系中,细胞被播种在六孔板中,孵育过夜,立即更换新鲜的无血清培养基。加入100μl1×108/毫升的纯血小板,培养至少48小时。为了探测血小板对肿瘤细胞侵袭的影响,我们在共培养系统进行transwell侵袭实验。条件培养基被收集来做明胶酶谱分析(gelatinzymography),提取培养细胞的蛋白质用于免疫印迹实验(westernblotting)。3.在细胞培养和共培养系统,我们使用特异性抗体封闭血小板p-selectin,并使用小干扰rna(sirna)敲掉bxpc3细胞的cd44,然后通过明胶酶谱分析(gelatinzymography)和免疫印迹实验(westernblotting)的方法探测mmp-9的表达和tn-c的表达。三、研究结果1.我们在103例胰腺癌组织中检测了tn-c和mmp-9的表达水平,分析了单表达和共表达这两个分子和胰腺癌患者的临床病理参数及生存预后的相关性。我们发现,在胰腺癌组织中,mmp-9和tn-c的表达水平是明显增加的。mmp-9和tn-c的共表达也是存在的。临床统计分析表明,MMP-9,TN-C和纤维TN-C(fTN-C)的表达水平与血管侵犯、淋巴结转移、肝转移和TNM分期是相关的。与此同时,我们发现MMP-9和TN-C的共表达与胰腺腺癌转移是显著相关的。生存分析显示,MMP-9或TN-C的单表达明显降低胰腺癌患者的总生存率,共表达MMP-9和TN-C的胰腺癌患者具有最低的总生存率。2.为了确定血小板对肿瘤细胞的影响,我们在血小板和胰腺癌细胞共培养体系中检测了MMP-9和TN-C的表达水平。我们发现,与单独的AsPc1和BxPc3细胞培养相比,在血小板与肿瘤细胞共培养体系中,肿瘤细胞穿透基底膜的能力是明显增加的,MMP-9和TN-C蛋白表达水平是增加的,尤其是小分质量TN-C片段。同时,MMP-9的活性也是明显增强的,尤其是BxPc3细胞。3.为了探索肿瘤细胞与血小板相互作用的分子机制,我们在血小板与BxPc3共培养体系中用特异性抗体封闭血小板P-selectin,我们发现MMP-9活性降低,MMP-9和TN-C蛋白表达水平也降低。我们用小干扰RNA(siRNA)敲掉BxPc3细胞的CD44,然后与血小板进行共培养,我们发现MMP-9活性也是降低的,MMP-9和TN-C蛋白表达水平也明显降低。四、讨论1.MMP-9和TN-C的共表达可能促进肿瘤转移,从而影响胰腺癌的进展。并且这两个分子的共表达可能暗示了胰腺癌患者的预后较差。2.肿瘤细胞和血小板的相互作用会诱导MMP-9分泌和TN-C形成,并促进胰腺癌细胞侵袭和转移。3.肿瘤细胞和血小板相互作用可能是通过CD44和P-selectin的结合实现的,这将为临床治疗提供新的靶点。