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【目的】无机砷化合物是确定的人类致癌物,但由于动物致癌模型尚未成功建立,导致对其致癌机制的研究长期滞后。细胞恶性转化的体外细胞模型已被广泛用于无机砷化合物的致癌作用及机制研究。近年提出的众多砷致癌机制假说中,氧化应激学说受到广泛关注。通过前期研究,课题组发现,无机砷诱导细胞发生恶性转化过程中,细胞内伴随氧化-抗氧化失衡,细胞中重要的抗氧化信号通路Keap1-Nrf2/ARE中核转录因子Nrf2持续高表达,这一持续累积的Nrf2在砷致细胞恶性转化过程中对加速细胞增殖和抵制细胞死亡起着十分重要的作用,但具体分子机制尚不清楚。本课题利用1.0μmol/L亚砷酸钠(Na As O2)长期染毒致永生化人皮肤角质形成细胞(Ha Ca T)恶性转化细胞模型,研究砷致细胞恶性转化过程中不同阶段自噬的动态变化情况,并进一步探讨核转录因子Nrf2对自噬作用及其调控机制,为砷致癌分子机制研究提供新的科学依据。【方法】1、Na As O2致Ha Ca T细胞恶性转化过程中不同阶段自噬的动态变化情况:(1)采用Weshtern blot检测0.0和1.0μM Na As O2染毒0、1、7、14、21、28、35代Ha Ca T细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p62的表达水平;(2)采用RFP-LC3慢病毒转染后,荧光显微镜观察0.0和1.0μM Na As O2染毒早、中、晚(即1、14和35代)细胞内自噬水平的动态变化;(3)正常Ha Ca T和1.0μM Na As O2染毒35代的恶性转化的Ha Ca T细胞(T-Ha Ca T)细胞,利用自噬降解阻断剂Bafilomycin A1(Baf A1)、启动激活剂Rapamycin和启动抑制剂Wortmannin干预后,采用Western blot检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的变化情况,鉴定自噬流的改变。2、无机砷诱导Ha Ca T细胞发生恶性转化过程中,核转录因子Nrf2对细胞自噬的调控作用:(1)细胞内氧化-抗氧化平衡相关指标检测:a、采用酶标仪检测0.0μmol/L和1.0μmol/L Na As O2染毒Ha Ca T细胞0、1、7、14、21、28、35代细胞内过氧化氢、超氧化物、4-HNE、MDA和SOD变化情况;b、采用Western blot检测抗氧化信号通路关键因子Nrf2及其下游抗氧化酶HO-1和SOD的表达变化情况。(2)核转录因子Nrf2调控Ha Ca T细胞内自噬的可能作用:a、对T-Ha Ca T细胞转染Nrf2si RNA,使细胞中的Nrf2表达降低,同时设立相应的正常传代对照组、恶性转化对照组、转染Con si RNA组,分别作为阴性对照组、阳性对照组和空白对照组后,采用Western blot检测Nrf2及自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p62的表达变化情况;b、在T-Ha Ca T细胞内加入自噬激活剂Rapamycin后,采用Western blot检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62以及Nrf2的表达水平。3、核转录因子Nrf2调控自噬的可能机制:(1)转录因子Nrf2通过Nrf2-m TOR信号通路调控自噬的发生:a、采用Western blot检测0.0和1.0μM Na As O2染毒Ha Ca T细胞各监测点(0、1、7、14、21、28、35)代细胞内PI3K/Akt/m TOR信号通路中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、m TOR、p-m TOR的蛋白表达情况;b、在T-Ha Ca T细胞内转染Nrf2 si RNA,使细胞中的Nrf2表达降低,同时设立相应的正常传代对照组、恶性转化对照组、转染Con si RNA组,分别作为阴性对照组、阳性对照组和空白对照组后,采用Western blot检测细胞中PI3K/Akt/m TOR信号通路中的p-PI3K、p-Akt、p-m TOR以及自噬标志蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62的蛋白表达变化情况。c、在T-Ha Ca T细胞加入PI3K的抑制剂LY294002抑制PI3K蛋白表达后,采用Western blot检测细胞内p-Akt、p-m TOR、Nrf2以及自噬标识性蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p62的蛋白表达变化情况。d、在T-Ha Ca T细胞内加入m TOR的抑制剂Rapamycin抑制m TOR的表达后,采用Western blot检测细胞内Nrf2、Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62的蛋白表达变化情况。(2)转录因子Nrf2通过Nrf2-Bcl2-Beclin1调控自噬的表达:a、采用Western blot检测0.0μmol/L和1.0μmol/L Na As O2染毒Ha Ca T细胞各监测点(0、1、7、14、21、28、35)代细胞内Bcl2蛋白的表达变化情况;b、在T-Ha Ca T细胞内转染Nrf2 si RNA,抑制Nrf2的表达后,同时设立相应的正常传代对照组、恶性转化对照组、转染Con si RNA组,分别作为阴性对照组、阳性对照组和空白对照组,再次采用Western blot检测细胞中Bcl2以及自噬标志蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62的蛋白表达变化情况。c、在T-Ha Ca T细胞内转染Bcl2 si RNA,使细胞中的Bcl2表达降低,同时设立相应的正常传代对照组、恶性转化对照组、转染Con si RNA组,采用Western blot检测细胞中Nrf2以及自噬标志蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62的蛋白表达变化情况。【结果】1、Ha Ca T细胞恶性转化过程中自噬的改变情况:(1)随着染毒代数的增加,Beclin1的蛋白表达量在1代至14处于高表达状态,且均高于正常传代对照组(p<0.05),染毒持续至14代以后,上述蛋白的表达量逐渐降低,且与正常传代对照组以及0代细胞相比,差异均有统计学意义(p<0.05)。而LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表达量在14代以前呈现上升趋势,且14代其表达量显著高于正常传代对照组与0代细胞(p<0.05);在14代以后,随着染毒代数的增加,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表达量表达均逐渐降低,至35代时细胞中的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的表达量显著低于传代对照组以及0代细胞(p<0.05);同时自噬降解阶段关键蛋白p62随着染毒代数的增加而呈现持续上升的趋势,在14代以后表达量持续高于正常传代对照组以及0代细胞(p<0.05)。(2)RFP-LC3慢病毒荧光斑点结果显示,随着染毒代数的增加,1.0μmol/L Na As O2长期染毒Ha Ca T细胞内LC3荧光斑点数呈现上升趋势,至14代时,染毒组细胞内LC3荧光斑点数显著高于正常传代对照组以及染毒1代细胞(p<0.05);持续染毒至中后期,染毒组细胞内LC3荧光斑点数逐渐下降,至35代时,染毒组细胞内LC3荧光斑点数显著低于正常传代对照组以及染毒1代细胞(p<0.05)。(3)同时采用8μmol/L Na As O2处理T-Ha Ca T细胞和正常传代对照组细胞后,正常传代对照组以及T-Ha Ca T细胞内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表达量均显著升高,且实验组内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达量显著低于正常对照组(p<0.05);在8μmol/L Na As O2处理组中进一步加入Wortmannin处理后,与处理前相比,T-Ha Ca T以及正常传代对照组细胞内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达量均显著下降(p<0.05);在8μmol/L Na As O2处理组中进一步加入Baf A1处理组中,与处理前相比,T-Ha Ca T以及正常传代对照组细胞内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达水平均显著升高(p<0.05),但是T-Ha Ca T细胞内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达量仍低于正常传代对照组(p<0.05);在8μmol/L Na As O2处理组中进一步加入Baf A1处理组中,与处理前相比,加入Rapamycin处理组中T-Ha Ca T和传代对照组细胞内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均显著上升(p<0.05),但与正常对照组相比,T-Ha Ca T细胞内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达量仍然较低(p<0.05)。2、Ha Ca T细胞恶性转化过程中核转录因子Nrf2对自噬的作用:(1)a、随着染毒代数的增加,1.0μmol/L Na As O2染毒组细胞内过氧化氢和超氧化物的含量呈现先上升后下降的趋势,在1代至14代,染毒组细胞内过氧化氢和超氧化物含量均显著高于正常传代对照组以及0代细胞(p<0.05);14代以后,染毒组内过氧化氢和超氧化物水平逐渐下降,14代以后,染毒组细胞内的表达量与正常传代对照组相比均无统计学差异。MDA含量在染毒1代和7代表达量显著高于正常传代对照组以及0代细胞(p<0.05),随后逐渐下降,至14代以后,染毒组细胞内的表达量与正常传代对照组相比均无统计学差异。细胞内4-HNE含量在染毒1代急剧上升达到峰值,显著高于正常传代对照组以及0代细胞(p<0.05),至染毒中后期,染毒组细胞内的表达量正常传代对照组相比,均无统计学差异。b、Western blot检测0.0和1.0μM Na As O2染毒Ha Ca T细胞0、1、7、14、21、28、35代细胞内Nrf2及其下游HO-1和SOD的表达结果显示,Nrf2的蛋白表达量在染毒1代开始上升,在14代以后表达量稳定维持在较高水平,与正常传代对照组细胞以及0代细胞相比均有明显统计学差异(p<0.05);其下游靶基因HO-1的表达在7代以后显著增加,14代以后稳定维持在较高水平,与正常传代对照组细胞以及0代细胞相比均有统计学差异(p<0.05);细胞内SOD酶活力结果显示,在7代以后,SOD活力显著升高,至35代时细胞内SOD活力水平显著高于正常传代对照组以及0代细胞(p<0.05)。(2)a、T-Ha Ca T细胞内转染Nrf2 si RNA后,与非转染组T-Ha Ca T细胞相比,转染组T-Ha Ca T细胞内Nrf2和p62的表达水平显著降低(p<0.05),与此同时,细胞自噬相关蛋白Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达上升(p<0.05);b、在T-Ha Ca T细胞内加入自噬激活剂Rapamycin后,与非处理组T-Ha Ca T细胞相比,Rapamycin处理组细胞内Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达显著上升,但是,p62以及Nrf2的蛋白表达无显著变化。3、Ha Ca T细胞恶性转化过程中核转录因子Nrf2对自噬调控的可能机制:(1)随着染毒代数的增加,细胞内p-PI3K/PI3K,p-Akt/Akt,p-m TOR/m TOR的蛋白表达呈持续上升趋势,至染毒14代以后,稳定维持在较高水平,与正常传代对照组细胞以及0代细胞相比,差异有统计学意义(p<0.05)。在T-Ha Ca T细胞内转染Nrf2 si RNA使Nrf2低表达后,与空白对照组相比,转染组T-Ha Ca T细胞内p-PI3K、p-Akt的蛋白表达无显著变化,p-m TOR和p62的蛋白表达明显下降,与未转染组相比差异有统计学意义(p<0.05),同时Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表达量显著上升(p<0.05);在T-Ha Ca T细胞内加入PI3K抑制剂LY294002抑制PI3K的表达后,与未转染组T-Ha Ca T细胞相比,LY294002处理组细胞内p-Akt,p-m TOR,Nrf2的蛋白表达水平降低(p<0.05),而Beclin1以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表达增加(p<0.05),p62的表达改变无统计学意义;在T-Ha Ca T细胞内加入m TOR抑制剂Rapamycin后,与未转染组T-Ha Ca T细胞相比,Rapamycin处理组细胞内Nrf2以及p62的蛋白表达无显著变化,而Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表达水平则明显升高(p<0.05)。(2)随着染毒代数的增加,1.0μmol/L Na As O2染毒组内细胞中Bcl2蛋白表达持续上升,且均显著高于正常传代对照组细胞(p<0.05)。在T-Ha Ca T细胞内转染Nrf2 si RNA使Nrf2低表达后,与空白对照组相比,转染组T-Ha Ca T细胞内Bcl2和p62的蛋白表达水平显著下降(p<0.05),同时细胞内自噬标志性蛋白Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表达水平显著上升(p<0.05);在T-Ha Ca T细胞内转染Bcl2 si RNA使Bcl2低表达后,与空白对照组相比,转染组T-Ha Ca T细胞内Nrf2以及p62蛋白表达无显著改变,而自噬标志性蛋白Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表达显著增加(p<0.05)。【结论】1、砷致Ha Ca T细胞恶性转化过程中伴随自噬能力的缺损,具体表现为自噬起始阶段激活能力下降,同时自噬流降解阶段被抑制。2、砷致Ha Ca T细胞恶性转化过程中核转录因子Nrf2的持续高表达与细胞内自噬能力的异常密切相关。3、砷暴露激活PI3K/Akt信号通路,进而导致核转录因子Nrf2的持续高表达,并通过Nrf2-m TOR以及Nrf2-Bcl2-Beclin1信号通路调控细胞自噬。