研究背景:氨肽酶N（APN/CD13）是一类锌离子依赖型的膜结合型外肽酶,在许多组织细胞包括肾脏、小肠、肝脏及中枢神经系统中广泛表达。它能影响免疫功能和主要的生物学过程,包括细胞的增殖、分泌、侵入、血管发生等,参与细胞基质的水解和内源性生物活性分子脑啡肽和内啡肽降解的失活。另外,氨肽酶N也是人冠状病毒TEGV和229E的受体。研究证明,APN在肿瘤发生、机体免疫功能调节以及病毒感染中发挥着重要的作用:（1）降解细胞外基质,促进原发肿瘤的生长侵袭,有利于肿瘤细胞的侵袭转移,促进肿瘤生长;（2）氨肽酶N是肿瘤新生血管的调节器,可以促进肿瘤新生血管的形成,在肿瘤细胞试验中发现,APN表达可增强肿瘤细胞的侵袭力;（3）降解胸腺肽和白介素,降低机体免疫机能,加速肿瘤转移恶化。研究证明,氨肽酶N参与多种细胞表面肽酶的连续降解过程,因此是研究抗肿瘤抗病毒药物的一个重要靶点。本研究以氨肽酶N为靶点,根据E.Coli氨肽酶N（eAPN）的三维晶体结构以及Bestatin与eAPN作用模式,通过计算机辅助合理药物设计,合成了四个系列共88个肉桂酰天冬氨酸类衍生物,并对它们进行初步的活性筛选,以期发现具有良好的氨肽酶N抑制活性的抗癌先导化合物。研究方法:本研究以Bestatin作为先导物,利用计算机辅助药物设计技术,寻找到与eAPN活性中心区域匹配良好的肉桂酰天冬氨酸骨架。利用计算机Sybyl软件系统将该骨架和Bestatin的母核AHPA进行比对,发现二者与eAPN的活性中心作用模式相似,并且表面的静电势也极为相似。在构建的母核肉桂酰天冬氨酸结构基础上,将不同的结构片段与之拼接后再利用柔性对接模拟目标化合物与靶酶的作用模式,依此对肉桂酰天冬氨酸骨架的侧链进行结构修饰,合理设计目标化合物。本研究以L-天冬氨酸作为起始原料,经甲酯化,缩合、水解、环合等反应得到关键中间体环状酸酐,再经氨解反应和缩合反应得到目标化合物。其化学结构经过红外光谱,电喷雾质谱和核磁共振谱得到确证。经查阅文献证实,所合成的目标化合物为新型化合物,未见文献报道。实验结果:本研究对设计、合成的四个系列的88个肉桂酰天冬氨酸骨架结构的化合物进行了体外初步生物活性评价,体外抑酶活性实验显示大部分化合物对氨肽酶N具有抑制活性,其中化合物B₂,B₄,B₁₁,B₁₅,B₁₆,B₁₇,B₁₈和D₁显示了较好的抑酶活性。初步构效关系分析显示,含有苯环和短脂肪链的氨基侧链的化合物活性较强。芳环上取代基的种类和位置不同也影响目标化合物的活性:一般是供电子基取代的活性优于吸电子基取代的,邻对位取代优于间位取代。但是含有羟肟酸结构的化合物抑酶活性明显高于含羧基的化合物。可能是羟肟酸的结构更利于目标化合物与锌离子螯合,也更容易伸入活性中心的疏水性口袋的缘故。其中化合物B₂,B₁₅,D₁的IC₅₀分别为的5.9μM,11.1μM和6.7μM,接近于阳性对照药Bestatin(IC₅₀:3.6±0.6μM)的氨肽酶N抑制水平。通过MTT法体外细胞实验测定了目标化合物对白血病细胞HL-60的生长抑制作用,结果显示对APN酶抑制作用强的化合物如B₂,B₁₁,B₁₂,D₁同样具有很强的HL-60细胞抑制活性。B₂、B₁₁和D₁的IC₅₀分别为0.59±0.06 mM、0.47±0.04mM和0.57±0.08mM,均超过了Bestatin(IC₅₀=0.66±0.07 mM)。结论:本研究基于氨肽酶N的晶体结构及抑制剂与酶的作用模式,充分利用了计算机辅助药物设计软件的优势,对已知活性化合物构建药效团并对所构建的小分子化合物库进行虚拟筛选,发现了匹配良好的肉桂酰天冬氨酸骨架。通过深入研究E.Coli APN的三维结构以及酶-抑制剂复合物的结合模式,用柔性对接来模拟目标化合物与靶酶的相互作用,对肉桂酰天冬氨酸骨架的侧链进行合理设计并实现定向合成。所设计的合成路线科学合理,原料经济易得,且在细胞培养中未见明显的细胞毒作用。通过初步的活性筛选,发现了多个活性较强,结构全新的抗癌先导化合物,具有进一步研究的价值。同时基于化合物结构和活性数据建立了有一定预测能力的定量构效关系模型,可为创新性抗肿瘤药物的研究开发提供新的结构骨架和研究方向。