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目的:异质性耐药(Heteroresistance,HR)是细菌由敏感状态进化至耐药状态的中间阶段和必经过程,但其产生原因尚不明确。本研究探讨了碳青霉烯异质性耐药铜绿假单胞菌(CarbapenemheteroresistancPseudomonas aeruginosa,CHPA)的分子流行病学、耐药机制、患者独立危险因素和临床转归,以及大肠埃希菌碳青霉烯异质性耐药(Carbapenemheteroresistanc Escherichia coli,CHEC)的分子机制,以便更好的了解CHR在不同菌种间的发生发展过程。方法:回顾性收集重庆医科大学附属第一医院2011年1月到2015年12月无菌体液中分离的非重复铜绿假单胞菌451株,Vitek2 Compact系统完成菌株药敏实验,纸片扩散法(Kirby-Bauer disk diffusion test,K-B 法)、菌落谱型分析(Population Analysis Profile,PAP)和Time-Killing实验完成异质性耐药表型检测,脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)完成CHR菌株同源性检测及分子流行病学特征分析;微量肉汤稀释法检测异质性耐药原始菌和PAP实验最高浓度下生长的耐药亚群的MIC值,RT-qPCR(Quantitative Real-time PCR)方法检测异质性耐药原始菌和PAP实验最高浓度下生长的耐药亚群的外排泵基因、膜孔蛋白基因和产AmpC酶基因表达水平;统计临床资料并运用SPSS.21软件分析CHR菌感染的独立危险因素及CHR发生率与碳青霉烯抗生素使用量的相关性。此外,K-B法初筛E.coli对亚胺培南(Imipenem,IPM)异质性耐药表型,并经菌落谱型分析实验证实;PCR(Polymerase chain reaction)扩增及测序的方法检测亚胺培南异质性耐药大肠埃希菌(IPM-heteroresistant,IPM-HR)中与碳青霉烯耐药有关的基因,包括碳青霉烯酶基因、超广谱β-内酰胺酶(Extended Spectrum Beta-Lactamases,ESBLs)基因和膜孔蛋白(Outer membrane proteins,OMPs)基因;基因替换技术进行膜孔蛋白OmpF突变序列的替换,并进行相关验证。结果:1、铜绿假单胞菌碳青霉烯异质性耐药及机制研究结果如下:(1)统计K-B法药敏结果发现:P.aeruginosa对IPM的药敏情况为:异质性耐药菌株245株(占54.3%),敏感菌株126株(占27.9%),耐药菌株69株(占15.3%),中介菌株11株(占2.5%)。而对MEM的药敏情况分别为:异质性耐药菌株327株(72.5%),敏感菌株76株(16.9%),耐药菌株40株(8.7%),中介菌株8株(1.9%)。进一步分析2011年到2015年无菌体液分离的451株铜绿假单胞菌的异质性耐药率,发现MEM的异质性耐药率为72.5%,明显高于IPM的54.3%,且IPM和MEM的异质性耐药率逐年增加。(2)CHPA菌同源性分析结果显示:异质性耐药菌原始菌和PAP实验最高浓度下生长的耐药亚群PFGE谱型一致;而99株临床CHR菌株间PFGE谱型各异,并未出现3株及以上PFGE谱型相同的菌株。(3)CHPA耐药机制研究:异质性耐药原始菌与其耐药亚群的MIC值呈现8倍或16倍差异。与原始菌相比,IPM-HR和MEM-HR耐药亚群的AmpC基因表达分别增高了 1.04-1.32倍和1.14-1.43倍,但无统计学差异(P>0.05);IPM-HR和MEM-HR耐药亚群的外排泵基因表达均有所增高,但发现IPM-HR耐药亚群的MexB和MexE基因表达分别增高了 1.58-1.78倍和1.96-2.64倍,MEM-HR耐药亚群的MexB基因表达增高了 1.74-2.12倍,且有统计学差异(P<0.05);IPM-HR和MEM-HR耐药亚群的膜孔蛋白OprD基因表达下调了 0.56-0.12倍(P<0.05)。(4)危险因素分析结果显示:男性、引流管和先前使用碳青霉烯抗生素是IPM-HR菌感染的独立危险因素;而转院和先前使用碳青霉烯抗生素是MEM-HR菌感染的独立危险因素;先前使用碳青霉烯抗生素是IPM-HR和MEM-HR菌感染的共同独立危险因素。进一步分析IPM-HR发生率与碳青霉烯类抗生素使用量呈正相关,有统计学意义(P<0.001,r2=0.941),MEM-HR发生率与碳青霉烯类抗生素使用量也呈正相关,差异也有统计学意义(P<0.001,r2=0.918)。2、E.coli碳青霉烯异质性耐药机制研究结果如下:(1)K-B药敏结果发现大肠埃希菌N8591为IPM-HR菌并经PAP实验证实;该菌株对氨曲南、环丙沙星、庆大霉素、三代头孢和四代头孢菌素等绝大部分抗生素耐药,对厄他培南为低水平耐药(MIC值为2μg/mL),而对亚胺培南为异质性耐药。(2)对该菌株耐药基因检测发现其不表达blaaKPC、blaNDM-1、blaIMP和blaVIM等产碳青霉烯酶基因;检出ESBLs基因blaCTX-M-3;膜孔蛋白OmpF基因在序列788位点共发生19个碱基缺失,打乱了其阅读框架,导致膜孔蛋白OmpF缺失。(3)成功将N8591菌的OmpF突变序列替换到标准菌株ATCC25922的OmpF上,通过K-B药敏实验发现替换后的菌株ATCC25922/WompF株也出现IPM异质性耐药表型并得到PAP实验证实。随机选择4株IPM-HR菌,PCR扩增OmpF基因并测序比对,发现这4株菌的OmpF基因并未发生与N8591菌OmpF基因相同突变。结论:异质性耐药现象普遍存在,其发生机制可能也是多样复杂的:1、铜绿假单胞菌对IPM和MEM存在高异质性耐药率,这些临床菌株间未存在暴发流行情况,膜孔蛋白OprD基因表达下调合并外排泵基因表达增强是其主要耐药机制,而先前使用碳青霉烯类抗生素是CHPA菌感染的共同的独立危险因素。2、膜孔蛋白OmpF缺失可能是大肠埃希菌IPM-HR现象产生的机制之一。