肠病毒(Enteroviruses,EV)为小RNA病毒科中最主要的病毒属,包含12个种300多个型别,广泛感染人类。在基本消灭脊髓灰质炎后,以肠病毒71(Enterovirus71,EV71)和柯萨奇病毒A16(Coxsackie viruses A16,CA16)为主的包括CA6、CA10、CA5和CB3(Coxsackievirus B3)在内的多个型别肠病毒感染所引起的手足口病(hand foot and mouth disease,HFMD)成为肠病毒感染最严重的疾病,在我国及亚太其他地区持续高强度流行或散发,除了引发各种程度的临床病症外,还可导致死亡,严重威胁公共健康。目前,对于HFMD尚无特异有效的治疗药物和疫苗。宿主的体液免疫在防御病毒感染中起到举足轻重的作用,但目前对肠病毒在人群中的感染流行规律以及宿主如何抵抗、清除肠病毒感染的认识仍存在许多不足,给疾病的有效防治带来很多困难。在宿主应对EV71和CA16等肠病毒感染的体液免疫反应方面,目前的研究成果主要在中和抗体反应方面,肠病毒感染后宿主不仅产生中和抗体,也产生非中和抗体,这种非中和抗体反应如何产生,对中和抗体反应是否有影响,是否普遍存在于宿主的肠病毒感染过程中?本研究将对这些问题进行研究,以了解宿主非中和抗体反应的特点及意义,为深入、全面理解肠病毒与宿主相互作用规律提供新的资料,并最终能为提高肠病毒感染的防控水平提供新的视野。主要内容如下:一、人体抗-EV71衣壳蛋白非中和抗体反应特点的研究在全基因合成获得的EV71衣壳蛋白VP1、VP0和VP3的p MD-18T质粒的基础上,通过PCR方法获得EV71 VP0、VP3、VP1和VP1截短体抗原(VP11-60(1-60aa)、VP145-58(45-58aa)、VP141-297(41-297aa)、VP161-297(61-297aa)和VP1134-297(134-297aa))的DNA序列,构建原核表达载体,表达并纯化获得重组目的蛋白。以本室自主研发的新型免疫球蛋白结合分子(novel evolved immunoglobulin-binding molecule,NEIBM)LD5作为酶标二抗,建立抗-EV71衣壳蛋白抗体检测的NEIBM-ELISA方法。收集江苏省无锡市33份HFMD重症患者血清标本、194份非手足口病儿童门诊血清标本和200份上海市正常献血员血清标本。应用NEIBM-ELISA方法分析33份HFMD重症患者和200份正常成人血清抗-EV71衣壳蛋白VP1、VP0和VP3的非中和抗体反应。为进一步研究抗-EV71 VP1主要抗体反应表位,筛选正常成人、非HFMD门诊儿童和HFMD重症患者中抗-EV71 VP1高反应性血清标本,应用EV71 VP1不同截短体抗原(VP141-297、VP161-297、VP11-60、VP1134-297和VP145-58)对上述高反应血清进行NEIBM-ELISA检测,并用不同EV71 VP1截短体与全长VP1竞争结合三种人群高反应血清抗-EV71 VP1抗体,探讨EV71各结构蛋白及其抗原成分体液免疫反应特征,了解宿主对EV71及相关肠病毒感染的非中和抗体反应特点。结果发现,HFMD重症病例和正常成人血清中均存在高水平的抗-EV71三种结构蛋白(VP1+VP0+VP3)抗体反应,抗-EV71 VP1的抗体阳性率和反应性明显高于抗-EV71 VP0和抗-EV71 VP3;包含肠病毒共同交叉反应序列(the common enterovirus cross-reactive sequence,CEC RS)的VP141-297、VP11-60和VP145-58显示出较高的反应性,而不含CECRS的VP161-297和VP1134-297反应性较差;竞争抑制结果也显示,包含CECRS的全长VP1和VP1截短体抗原(VP141-297,VP11-60和VP145-58)抗-EV71 VP1的竞争水平明显高于不包含CECRS的VP1截短体(VP161-297),且不同VP1抗原对EV71 VP1抗体反应的竞争抑制模式在三种人群中也明显不同。以上结果说明人群普遍存在高水平的抗-EV71衣壳蛋白抗体反应,且以抗-VP1反应性最强,为优势抗体反应;进一步发现抗-EV71 VP1的抗体反应主要针对基于CECRS的各类表位,这些表位主要可分为3类:核心抗原(VP145-58)、N抗原(VP11-60)和C抗原(VP141-297)。VP11-297为全抗原,由CECRS抗原(核心抗原、N抗原和C抗原)和其他非CECRS抗原组成。与特异性强的中和抗体反应不同,我们用NEIBM-ELISA所检测的抗-EV71 VP1抗体反应具有反应强度大和交叉性强的特点,将其定义为非中和抗体反应,并假设其代表宿主的主要抗体反应(中和抗体代表宿主的次要抗体反应)。二、上海儿童抗-肠病毒VP1非中和抗体反应特点的研究应用重叠延伸PCR方法体外合成和逆转录PCR法获得来自EV-A(种)的EV71和CA16、EV-B的CB3、EV-C的PV1(human poliovirus1)和RV-A(rhinovirus,RV)的RV13(human rhinovirus A13)VP1的基因序列,构建p ET-21b-EV71 VP1、p ET-21b-CA16 VP1、p ET-21b-CB3 VP1、p ET-21b-PV1VP1和p ET-21b-RV13 VP1的原核表达载体,表达并纯化重组目的蛋白。应用NEIBM-ELISA和竞争ELISA检测364份上海市非HFMD儿童门诊血清标本(8个年龄段:<28d、1-6m、6m-12m、12m-24m、24m-36m、36m-48m、48m-60m和60m-72m)抗-5个肠病毒VP1非中和抗体反应水平;筛选获得各肠病毒抗-VP1高反应血清抗体,竞争ELISA进一步检测不同肠病毒抗-VP1非中和抗体反应,并将抗体反应性及竞争抑制反应性进行统计学差异和相关性分析。结果发现,不同肠病毒非中和抗体反应随年龄呈现与中和抗体相似的动态变化规律:新生儿(<28d)出生时即存在高水平的肠病毒VP1非中和抗体,随后逐渐消退,1-12m降至最低点后不断上升,48-60m达到峰值,60-72m明显下降(RV13除外)。根据此变化规律,将此动态分为3个阶段(<28d、1-12m和12-72m)进行5个肠病毒VP1非中和抗体反应水平和竞争抑制水平的分析比较,发现反应性和竞争抑制水平在<28d与12-72m显示明显的层级:RV13>CB3>PV1>CA16>EV71。5种VP1抗体反应性的相关性在12-72m显示3个层次:EV-A种之间最高(EV71和CA16),EV-A、B、C(肠道传播病毒种)之间次之,RV13与EV-A、B、C(肠道传播病毒种与呼吸道传播病毒种)之间最低,反应相关性在1-28d时显示出与在12-72 m大致相似的趋势。5种肠病毒VP1竞争抑制的相关性与与VP1序列同源性无关,在<28d和12-72m两个年龄段相差较大,12-72m年龄段较<28d显著下降。这些结果提示,<28d的新生儿肠病毒的非中和抗体代表母体转运的Ig G水平,1-12m主要反应母体非中和抗体水平消退至最低点并开始进入原发感染期,12-72m主要反应肠病毒原发感染期的状况。母体Ig G(<28d)与原发感染期(12-72m)肠病毒的非中和抗体水平和竞争抑制水平均显示明显的层级:经呼吸道传播的肠病毒RV-A(RV13)非中和抗体反应水平高于肠道传播的肠病毒,肠道传播的病毒EV-B(CB3)高于EV-C(PV1)高于EV-A,EV-A内CA16明显高于EV71。抗-各种肠病毒VP1在12-72m和<28d两个年龄段反应相关性与其VP1序列的同源性大致相符,竞争抑制的相关性则明显受序列同源性和抗体水平二者的影响。不同肠病毒抗-VP1竞争抑制水平及其相关系数在<28d和12-72m两个年龄段的差别反映了成年母体与原发感染期非中和抗体反应的不同。三、不同的抗-CA16 VP1非中和抗体反应的发现:特异性或非特异性的抗体反应在全基因合成的CA16 VP1-p MD-18T质粒的基础上,通过PCR方法获得CA16VP1全长及截短体抗原(p ET-21b-CA16 VP1、p ET-32a-VP141-297、p ET-32a-VP161-297、p ET-32a-VP11-60、p ET-32a-VP145-58)的DNA序列,构建其原核表达质粒,原核表达并纯化目的蛋白。应用NEIBM-ELISA和竞争ELISA的方法分析上海献血员和山西老年人两种人群血清抗-CA16 VP1非中和抗体反应水平,应用CA16 VP1全长及截短体抗原对上述高反应血清进行NEIBM-ELISA检测,并用不同CA16 VP1截短体与全长VP1竞争结合两种人群高反应血清抗-CA16 VP1抗体,并将抗体反应性及竞争抑制反应性进行统计学差异和相关性分析;同时测定两种人群不同竞争抑制类型抗-CA16中和抗体效价。结果发现,上海人群中抗-CA16 VP141-297抗体反应性显著高于VP161-297,且所有基于CECRS的抗原(VP11-297、VP141-297、VP11-60和VP145-58)对CA16 VP1的竞争抑制水平明显高于VP161-297;山西人群中,尽管抗-CA16 VP141-297的抗体反应性水平与VP161-297无统计学差异,但VP141-297对CA16 VP1的竞争抑制水平显著地高于VP161-297。进一步相关性分析发现,上海人群CA16各抗原抗体反应性的相关性和对全长VP1的抑制率的相关水平显著高于山西人群。基于VP11-60和VP141-297对CA16VP1在两种人群中显示不同的抑制水平,我们将两种人群抗-CA16 VP1的抗体反应分为11个抑制类型;上海献血员包含6种抑制类型,并出现1优势类型,占71.4%,显示为特异的竞争抑制类型;山西老年人共有9种抑制类型,无明显的优势类型,比例最高的竞争类型仅占28.3%,特异的竞争抑制类型仅占6.5%;上海献血员中特异抑制类型的中和抗体滴度明显高于其它抑制类型。结果提示,上海献血员抗-CA16 VP1非中和抗体反应与EV71相似,也主要针对基于CECRS的抗原。两种人群存在不同的抗-CA16 VP1的抗体反应和竞争抑制模式,上海献血员CA16 VP1各抗原反应相关性明显高于山西老年人,且各抗原抑制相关性也普遍明显高于山西老年人,显示抗-CA16 VP1抗体反应的一致性,提示上海献血员存在特异的抗-CA16抗体反应。上海献血员抗-CA16 VP1抗体反应出现优势竞争抑制类型,其中和抗体效价明显高于其他类型,符合特异抗体反应特性,为特异的CA16病毒感染所引起,山西老年人则显示出是由其它肠病毒感染引起的的非特异抗-CA16抗体反应特点。另外,抗-CA16 VP141-297与抗-CA16 VP11-297等反应相关系数和的竞争抑制相关系数的差异可用来提示不同人群CA16特异感染的流行水平。这些发现能够帮助理解宿主抗-CA16和其它肠病毒感染的体液免疫反应特点,并有助于找到有效的评估CA16及其相关肠病毒感染血清流行病学检监测的方法。四、非中和抗体反应在小鼠上的诱导及其对中和抗体反应影响的研究原核表达和纯化p ET21b-EV71、p ET21b-CA16、p ET21b-CA5、p ET21b-CA6、p ET21b-CA10、p ET21b-CB3、p ET21b-PV1和p ET21b-RV13等肠病毒的VP1抗原;设计各种方案,应用不同肠病毒VP1(除EV71 VP1或CA16 VP1外)交叉接种小鼠(交叉组),构建肠病毒交叉免疫模型以模拟人群非中和抗体反应情况,同时设置EV71 VP1(EV71组)或CA16 VP1(CA16组)接种组和阴性对照组,收集各免疫阶段的血清标本;表达纯化EV71和CA16 VP1的核心抗原、N抗原、C抗原、非CECRS抗原及全长VP1抗原,对上述血清标本进行ELISA和竞争ELISA分析,测定针对EV71 VP1和CA16 VP1各抗原抗体的动态变化情况,探讨以交叉反应为特征的肠病毒非中和抗体反应可能的形成机制及变化特点。在上述研究基础上,制备不包含EV71 VP1或CA16 VP1免疫的两种小鼠肠病毒交叉免疫模型,分别对上述小鼠模型及未进行交叉免疫接种的阴性对照和EV71 VP1或CA16 VP1免疫组小鼠接种EV71或C A1灭活6疫苗,收集接种前及接种后不同时期的小鼠血清,测定EV71实验组抗-EV71中和效价和CA16实验组抗-CA16中和抗体效价及其持续时间,探讨非中和抗体对诱导产生中和抗体的影响。通过不同肠病毒VP1蛋白免疫构建小鼠肠病毒交叉免疫模型,发现随着不同VP1交叉接种次数的增加,EV71交叉组抗-EV71 VP11-60反应性逐渐赶上并超过VP161-297,VP141-297反应性逐渐赶上VP11-297,EV71 VP1抗体反应向CECRS表位偏移。EV71组,抗-EV71抗体反应性与VP1抗原长度成比例,未出现向CECRS表位偏移。竞争ELISA也显示EV71交叉组包含C ECRS的EV71 VP1抗原能较好的抑制抗-EV71 VP1非中和抗体反应。不同VP1分别对EV71交叉组和EV71组小鼠抗-EV71 VP1和抗-CA16 VP1的4种竞争抑制模式显示出各自的特点,在上海市<28d儿童各种肠病毒VP1的竞争抑制反应中出现了分别与4种竞争抑制模式相对应的情况。上述结果提示,肠病毒VP1蛋白交叉免疫小鼠可成功诱导出与人群中相似的非中和抗体反应,提示某种肠病毒感染诱导的抗-VP1反应可形成对其他肠病毒VP1的交叉反应,多种肠病毒的感染可导致非中和抗体反应向CECRS表位偏移。在已构建测的小鼠肠病毒交叉免疫模型的基础上,将EV71交叉组、EV71组和阴性对照组三组小鼠再接种两次EV71灭活疫苗,抗-EV71中和抗体测定结果显示,疫苗免疫后不同时间段内,EV71交叉组小鼠的抗-EV71中和抗体的水平和持续时间与阴性对照组并无显著差异。在CA16交叉组、CA16组和阴性对照组中,CA16疫苗首次免疫后,三组小鼠中和抗体水平相似且无统计学差异;CA16疫苗二次免疫后,三组小鼠血清抗-CA16中和抗体水平均提高,且阴性对照组小鼠血清中和抗体水平出现高于CA16交叉组和CA16组的趋势,CA16交叉组中和抗体水平出现低于CA16组的趋势。上述结果提示,以交叉反应为主的非中和抗体的存在对后续EV71感染诱导中和抗体反应没有影响,但对CA16感染诱导产生中和抗体可能有一定的影响。总结:本研究我们首次发现了主要针对CECRS表位的抗-EV71 VP1抗体反应,提出人肠病毒非中和抗体反应的概念。检测发现正常成人、老年人、手足口病患儿和不同年龄段儿童等各类人群中普遍存在各肠病毒抗-VP1非中和抗体反应。首次在婴幼儿中系统、全面地观察到从出生到6岁时与中和抗体相似的各肠病毒抗-VP1非中和抗体反应的动态变化过程,提出了母体转移Ig G抗体反应和原发感染抗体反应概念。在小鼠模型上可成功诱导出与人群中的非中和抗体反应相似的抗-EV71 VP1/CA16的非中和抗体反应,发现了多种肠病毒感染导致非中和抗体反应向CECRS表位偏移的人肠病毒非中和抗体反应可能的形成机制。在小鼠模型中观察到,非中和抗体的存在可能会对EV71和CV16疫苗诱导中和抗体产生不同影响的线索。通过这些研究,我们获得肠病毒非中和抗体反应比较全面系统的信息,补充我们对肠病毒宿主体液免疫反应的认知,帮助进一步深入、全面理解肠病毒与宿主相互作用规律,提高肠病毒感染的防控水平,同时也可为肠病毒感染抗体检测及流行病学监测方法的建立等研发提供重要病毒基础免疫学数据。