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[目的]构建Wnt3a基因沉默的骨质疏松(osteoporosis,OP)大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)体系,研究 Wnt 通路中 Wnt3a及β-catenin关键分子的表达,并探索老鹳草素干预其表达的作用。[方法]1.分离去卵巢(ovariectomy,OVX)大鼠的BMSCs,分为假手术大鼠组、模型大鼠组、模型组BMSCs给予老鹳草素(10-9mol/L)处理,用茜素红及ALP活性检测验证老鹳草素对BMSCs是否有成骨分化的作用。2.RNA芯片技术检测各组BMSCs基因表达谱差异,对上调差异基因的表达进行筛选。并与模型组作比较,对老鹳草干预后变化的基因,特别是与BMSCs成骨分化相关的关键基因进行cluster聚类、GO分析、以及pathway功能分布。3.确定上述老鹳草素干预组中表达上调的关键基因,采用RNAi沉默技术,针对目的基因设计构建3条干扰序列,并包装慢病毒,以慢病毒作载体携带上述沉默基因转染入BMSCs内,构建稳转BMSCs细胞系,并用RTQ-PCR验证。4.用老鹳草素进行干预稳转BMSCs细胞14d后,采用CCK8法检测BMSCs的存活率,并用荧光定量PCR和Western blot检测Wnt3a和β-catenin的表达情况。[结果]1.茜素红染色法果显示10-9mol/L老鹳草素组钙结节的数量显著增加,ALP活性检测结果与茜素红染色结果一致。进一步验证了老鹳草素具有促BMSCs成骨分化的作用。2.分析基因芯片数据,利用KEGG数据库对上调差异基因进行Pathway分析,筛选出老鹳草素明显上调的基因是Wnt3a。3.针对目的基因设计3条干扰序列,测序验证构建质粒的序列正确,Wnt3a慢病毒干扰质粒的构建成功。将构建好的Wnt3a干扰质粒转染BMSCs,可以构建Wnt3a基因沉默稳转细胞系。4.与S-Wnt3a细胞组比较,S-Wnt3a细胞+老鹳草素组细胞存活率明显增加(cP<0.05);与M-Wnt3a细胞组比较,M-Wnt3a细胞+老鹳草素组细胞存活率明显增加(dp<0.05)。5.沉默Wnt3a后,BMSCs的Wnt3a与β-catenin蛋白及其mRNA表达均明显下降且成正相关。与M-Wnt3a细胞组比较,M-Wnt3a细胞+老鹳草素组的Wnt3a和β-catenin蛋白及其mRNA的表达明显增加(dp<0.05)。[结论]1.老鹳草素能明显促进骨质疏松大鼠BMSCs的体外成骨分化能力。2.Wnt3a基因沉默抑制BMSCs的增殖、降低Wnt3a和β-catenin的表达。3.老鹳草素促进Wnt3a基因沉默BMSCs的增殖,增加Wnt3a和β-catenin的表达。