红霉素胁迫下典型藻类的生长抑制效应及作用机制研究

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近些年来,抗生素类药物在全世界范围内的生产量和使用量越来越大,并且在饮用水和污水处理厂的排放水中常能检测到抗生素的存在。由于抗生素的密集使用和持续释放,世界各地的水体和土壤中都发现了高浓度且持续的抗生素。这种严重污染会破坏人类健康并加剧生物体耐药性相关的风险。此外,抗生素及其代谢物对生物和人体具有潜在和持久的危害,这使得抗生素在环境中的残留问题突出。红霉素(ERY)是一种常见的大环内酯类抗生素,在临床治疗过程中的使用量也很大,因此ERY在水体环境中的浓度也相对较高。本研究首先建立了一种简单、快捷、准确检测水体中抗生素浓度的方法;其次,根据OECD(1984,2011)导则,ERY对四种藻类的半最大效应浓度(EC50)实验,确定了用来评估ERY风险的最佳藻类;然后在宏观层面探究了不同浓度ERY对两种藻类生理情况的影响;此外,通过转录组学技术与代谢组学技术,分别从基因与代谢物层面探究了ERY对羊角月牙藻分子层面的影响。本论文的研究成果如下:(1)本论文通过固相萃取(SPE),水浴氮吹和安捷伦1290高效液相色谱-6470质谱联用仪建立了微量ERY的检测方法,ERY和ERY替代物(ERY-13C,d3)标椎曲线的相关系数(R2)都大于0.999,藻液加标3个浓度ERY的回收率大于70%。为了减小ERY检测过程中的误差,我们使用了内标法监测ERY的浓度,内标物为阿特拉津-d5。(2)小球藻、羊角月牙藻、水华鱼腥藻和聚球藻暴露于不同浓度ERY,4天后,根据细胞密度计算ERY对4种藻类的EC50值。本研究中测定的EC50值为小球藻:26.3300 mg/L;羊角月牙藻:0.0634 mg/L;水华鱼腥藻:0.0102 mg/L;聚球藻:0.0045mg/L。因此可知小球藻对ERY的敏感性最弱,聚球藻对ERY的敏感性最强。(3)本研究对比了不同浓度ERY对小球藻和羊角月牙藻的生长抑制、氧化应激和光合色素的变化。20、40、60μg/L浓度ERY促进了小球藻的生长,然而,只有20μg/L浓度ERY促进了羊角月牙藻的生长,40、60μg/L浓度ERY严重抑制了羊角月牙藻的生长。ERY可以通过影响藻类细胞内的活性氧(ROS)含量变化来影响两种藻类的生长。ERY的暴露并未显著影响小球藻的ROS含量,却显著提高了羊角月牙藻内的ROS含量。为了对抗细胞内过量的ROS,羊角月牙藻内的抗氧化剂活性也会升高。各浓度ERY对两种藻类的光合色素含量变化没有显著的影响,但小球藻的光合色素含量明显高于羊角月牙藻。以上结果说明小球藻应对ROS的能力强于羊角月牙藻。(4)利用转录组学技术研究了不同浓度ERY(4、80、120μg/L)对羊角月牙藻分子层面的影响。4μg/L的ERY促进了羊角月牙藻的生长,80、120μg/L的ERY抑制了羊角月牙藻的生长。在4、80、120μg/L的ERY处理组中,分别鉴定了218个(198个上调,20个下调)、950个(332个上调,618个下调)、2896个(1299个上调,1597个下调)差异表达基因(DEGs)。4μg/L的ERY上调了与DNA复制通路相关的基因,进而促进羊角月牙藻的生长。80、120μg/L的ERY抑制了羊角月牙藻的异生物质代谢、脂质代谢、DNA复制和修复、碳固定、光合作用色素合成、维生素的合成、甾体生物合成等通路,进而抑制羊角月牙藻的生长。(5)利用代谢组学技术研究了不同浓度ERY(4、80、120μg/L)对羊角月牙藻分子层面的影响。与对照组相比,在4μg/L的ERY胁迫下,羊角月牙藻的细胞密度升高;而在80和120μg/L的ERY胁迫下,羊角月牙藻的细胞密度降低。与对照组相比,4、80、120μg/L的ERY处理组在两种离子模式下分别有72个(37个上调,35个下调)、178个(94个上调,84个下调)、200个(106个上调,94个下调)(正离子模式)和232个(110个上调,122个下调)、772个(196个上调,576个下调)、823个(199个上调,624个下调)(正离子模式)个差异代谢物。4μg/L的ERY促进了羊角月牙藻嘌呤代谢、脂肪酸生物合成、牛磺酸和低牛磺酸代谢、ATP结合家族(ABC)转运蛋白、丙酮酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢,进而促进了羊角月牙藻的生长。80、120μg/L的ERY抑制了羊角月牙藻的ABC转运蛋白、氨基酸的生物合成、嘌呤代谢、2-Oxocarboxylic酸代谢、嘧啶代谢等代谢通路,进而抑制羊角月牙藻的生长。
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