果蝇精巢Hub组织的荧光标记及effete调控果蝇精巢生殖干细胞数量的研究

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干细胞维持由特殊的微环境,或称干细胞的微生态系统(niche)产生的外源因子以及其自身产生的内源因子共同调控。而内、外源因子对干细胞调控机制目前还知之甚少。果蝇精巢中,生殖干细胞(GSC, germline stem cell)围绕着一个由10到15个体节细胞构成的Hub组织,此组织即为果蝇精巢生殖干细胞的微环境。干细胞维持与分化相关调控因子的研究将为生殖生物学和干细胞生物学的发展提供有价值的资料。本课题以果蝇精巢生殖干细胞为研究对象,对 Hub组织进行了遗传学标记;同时研究了effete基因缺失对果蝇精巢干细胞数量的影响。  首先,利用eGFP(enhanced green fluorescent protein)的荧光标记功能,从果蝇基因组中扩增DE-cadherin特异性启动子,构建了上皮钙粘素 DE-cadherin特异性启动子驱动gfp报告基因的表达载体,通过转基因显微注射技术获得转基因果蝇品系,用免疫组织化学方法对果蝇精巢Hub组织进行荧光染色。结果显示, eGFP蛋白在Hub组织中大量表达。此项工作将为今后精巢生殖干细胞的定性与定量提供便利。  其次,研究了果蝇的 effete基因对精巢生殖干细胞维持的影响。effete基因(eff,也称为UbcD1)从酵母到人类都高度保守,编码一种E2泛素结合酶。本课题采用免疫组织化学方法,统计了野生型对照w1118与effete基因突变体果蝇在羽化后第2天、第7天及第14天其精巢生殖干细胞的数量情况。研究结果表明,在第2天、第7天和第14天拥有正常精巢GSC数量的精巢的百分数比例,野生型果蝇分别为:91.4%,87.5%和85.7%;而effete基因突变体果蝇分别为:88.9%,35.0%和16.0%。统计数据显示,羽化后第2天,实验组与对照组果蝇的精巢GSC无明显差异,GSC平均数目仍然处于正常范围7-10个之间。羽化后第7天和第14天,突变体品系果蝇精巢 GSC与野生型对照相比有明显差异,精巢 GSC平均数量低于正常水平。结果表明,effete基因缺失导致果蝇精巢干细胞数量的显著下降。  已有实验报道表明,effete基因是维持果蝇卵巢生殖干细胞所必需的内源性因子,是促进GSCs自我更新、抑制其提前分化所必需的重要因子。本实验结果暗示,effete基因可能在精巢干细胞中担负着相似的功能。Eff蛋白缺失可能促进了精巢生殖干细胞的分化,从而产生精巢干细胞缺失现象。
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