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[目的]:利用麦芽酚铝(Al(mal)3)对PC-12细胞进行染毒,从蛋白和基因的角度探讨铝对Wnt/β-catenin通路的影响,进而探讨麦芽酚铝通过Wnt/β-catenin通路致神经元凋亡的机制。
[方法]:1.PC-12细胞培养,分为两部分:1)第一部分设4个组,以Al(mal)3对细胞染毒,分为空白对照、100μmol/LAl(mal)3染毒组、200μmol/LAl(mal)3染毒组、400μmol/LAl(mal)3染毒组,染毒48小时;2)第二部分设5个组,分为空白对照组、DMSO对照组、单纯激动剂组、200μmol/LAl(mal)3染毒组、DMSO+200μmol/LAl(mal)3组和激动剂+200μmol/LAl(mal)3组,处理48小时。
21各项指标检测:1)CCK-8法和流式细胞术AnnexinVFITC-PI染色分别检测神经细胞活力及凋亡率;2)QRT-PCR、和Elisa法检测PC-12细胞Wnt3a、Dishelleved、β-catenin、GSK-3β、BCL-2/BAX、caspase-3mRNA及蛋白的表达。
[结果]:1.细胞活力结果:1)第一部分细胞:48小时染毒后PC-12细胞活力随着Al(mal)3浓度的增加逐渐降低;与空白对照组比较,低、中、高剂量组细胞活力均明显降低(P<0.05)。2)第一部分细胞:空白对照组、DMSO对照组和单纯激动剂组的细胞在处理后培养48小时,其细胞活力没有明显差别;与空白对照组相比,200μMAl(mal)3染毒组、DMSO+200μMAl(mal)3组以及激动剂+200μMAl(mal)3组细胞活力明显下降(P<0.05);其中激动剂+200Al(mal)3组相比200μMAl(mal)3染毒组,其活力又有明显升高(P<0.05)。
2.凋亡率结果:1)第一部分细胞:48小时染毒后PC-12细胞凋亡率随着Al(mal)3染毒浓度的增加逐渐上升,与空白对照组相比,三个染毒组细胞的凋亡率均明显增加(P<0.01);2)第二部分细胞:①与空白对照组相比,DMSO对照组和单纯激动剂组以及激动剂+200μMAl(mal)3组的细胞的凋亡率无明显变化,而200μMAl(mal)3组和DMSO+200μMAl(mal)3组的细胞凋亡率均明显增加(P<0.05);②与200μMAl(mal)3组相比,激动剂+200μMAl(mal)3组的细胞的凋亡率明显减少(P<0.05),而DMSO+200μMAl(mal)3组凋亡率无明显变化。
3.荧光定量PCR结果:1)第一部分细胞:①随着染毒剂量的升高,BAX、caspase-3基因含量呈升高趋势,BCL-2基因含量呈下降趋势,与空白对照组相比,中、高剂量组BAX、caspase-3基因含量明显增加(p<0.05),BCL-2基因含量明显降低(p<0.05);②随着染毒剂量的增加,GSK-3β基因含量呈升高趋势,Wnt-3a、Dishevelled、β-catenin基因含量呈下降趋势,;与空白对照组组相比,400μMAl(mal)3组GSK-3β基因含量明显增加(p<0.05);Wnt-3a、Dishevelled、β-catenin基因含量明显降低(p<0.05),200μMAl(mal)3组的Dishevelled基因含量也明显降低(p<0.05)。2)第二部分细胞:①与空白对照组相比,单纯激动剂组、DMSO对照组BCL-2、BAX、caspase-3基因的表达量均无明显变化,激动剂+200μMAl(mal)3组BCL-2、caspase-3基因表达量无明显变化,BAX基因表达量有明显升高(p<0.05),200μMAl(mal)3组和DMSO+200μMAl(mal)3组,BAX、caspase-3基因的表达明显升高(p<0.05),而BCL-2的表达明显下降(p<0.05);②与200μMAl(mal)3组相比,激动剂+200μMAl(mal)3组BAX、caspase-3基因表达量明显降低、BCL-2基因明显升高(p<0.05),而DMSO+200μMAl(mal)3组各基因均无明显变化。
4.ELISA结果:1)第一部分细胞:BAX、caspase-3蛋白的表达随着染毒剂量的增加呈升高趋势,BCL-2的表达随着染毒剂量的升高呈下降趋势,与空白对照组相比,中、高剂量组BAX、caspase-3蛋白的表达量明显增加(p<0.05),BCL-2蛋白表达量明显降低(p<0.01);2)第二部分细胞:①与空白对照组相比,单纯激动剂组、DMSO对照组BCL-2、BAX、caspase-3蛋白的表达量均无明显变化,激动剂+200μMAl(mal)3组BAX、caspase-3蛋白表达量无明显变化,BCL-2蛋白表达量有明显降低(p<0.05),200μMAl(mal)3组和DMSO+200μMAl(mal)3组,BAX、caspase-3蛋白的表达明显升高(p<0.05),而BCL-2的表达明显下降(p<0.05);②.与200μMAl(mal)3组相比,激动剂+200μMAl(mal)3组BAX、caspase-3蛋白表达量明显降低、BCL-2蛋白明显升高(p<0.05),而DMSO+200μMAl(mal)3组各蛋白均无明显变化。
[结论]:染麦芽酚铝可通过Wnt/β-catenin通路使PC-12细胞凋亡,而特异性激活Wnt/β-catenin通路,则可以减少麦芽酚铝引起的PC-12细胞凋亡。