鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma, OSCC)是最常见的头颈部恶性肿瘤(Head and neck squamous cell carcinomas, HNSCC),约占口腔恶性肿瘤的90%以上。流行病学研究证实其发病率呈明显上升趋势,已成为威胁人类健康的重要疾病之一。目前,手术切除联合放化疗仍是OSCC的重要治疗手段之一。随着长期使用化疗药物,癌细胞对化疗药物的敏感性逐渐下降,出现了多药耐药(Multidrug resistance, MDR)的现象,这种现象大大的影响了化学治疗的效果。研究认为,多药耐药现象可能与P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的表达及功能异常密切相关,因而P-糖蛋白介导的化疗药物外排增强也成为提高化疗药物敏感性的研究热点之一。P-gp是源于ATP-结合盒家族(ATP-binding Cassette superfamily, ABC)的一种跨膜磷酸糖蛋白,人类的P-gp由1280个氨基酸残基组成,相对分子量为170kd,因此又称为P-170,由一组MDR相关的基因编码,其中最重要的是MDR-1基因。P-gp分子由两部分组成,每一部分都包含有六个跨膜区以及一个核苷酸结合域。P-gp的二硫键近细胞质膜侧的第六及第八跨膜区具有膜转运功能。因此认为P-gp是一种细胞外排泵,其功能的行使需要ATP酶水解作用,其作用底物可以是外源性(药物)或内源性(类固醇激素、细胞因子)的物质,其可以将大量化合物,特别是水合阳离子的化合物从细胞内排至细胞外间隙,从而引起细胞内药物浓度降低,降低药物的疗效。P-gp并不是人体的异常蛋白,可在多种组织中发现,在不同组织细胞中P-gp作用均有不同,如在肝脏和肾脏影响药物的代谢与排除,在肠道影响药物的吸收,在中枢神经系统和循环系统影响药物的分布,它可使细胞内的药物浓度降低从而保护机体免受药物的损害。在人恶性肿瘤的有关研究中发现,P-gp的表达水平与化疗敏感性及患者生存率呈负相关。MDR-1基因具有多态性,但MDR-1基因的多态性表现并未影响细胞内药物的转运和患者病情发展。当抗肿瘤药物与肿瘤细胞长期接触后,诱导MDR-1基因扩增并且大量表达P-gp。环氧化酶(Cycloxygenase, COX)是花生四烯酸向前列腺素(prostaglandin,PG)转化过程中重要的限速酶,目前发现有2个亚型：COX-1和COX-2。COX-1是一种持续表达于正常组织细胞内的“结构酶”,能促进生理性前列腺素的合成,调节和维持组织细胞正常的生理活动,保持自身内平衡,具有重要的生理功能,如调节肾血流、保护胃黏膜及调节血小板功能等。研究证实前列腺素与癌细胞的生长转移密切相关,致癌基因、促癌剂和生长因子都能通过COX通路诱导前列腺素的合成,在许多肿瘤中也发现花生四烯酸的代谢呈升高状态,而这种现象被广泛认为是由COX-2酶诱导。COX-2是一种诱导型酶,其可被类似于促炎因子或生长因子等的细胞外刺激所激活。COX-2的过表达可见于胰腺、结肠、乳腺、肺、头颈癌等的肿瘤中,且与不良预后和差存活率相关。研究显示,结肠癌组织中COX-2的表达高于正常组织。在这些变异的组织中,COX-2的过表达发现在基质细胞、炎症细胞和表皮细胞中。相比之下,COX-1的表达在普通组织和肿瘤组织中没有明显的差异。但在包括胃、皮肤、膀胱、胰腺、肺和头颈的肿瘤组织中都发现COX-2的过表达,而COX-1则无明显差异,这表明在肿瘤的形成和生长过程中起关键作用的是COX-2。最近的研究也进一步证实促癌剂或致癌物的刺激能诱导COX-2的过表达,并对肿瘤的发生起促进的作用。此外COX-2过表达的癌细胞还可参与调节细胞生长、分化及炎症反应,刺激血管形成以及大量产生血管生成因子等。虽然我们前期研究初步证实口腔癌的发生与COX-2的过表达有关,但它们之间互相作用的机制尚不十分清楚。近年来研究发现,COX-2与P-gp的表达呈密切的正相关。我们前一阶段的实验研究指出,经过COX-2抑制剂塞来昔布处理KB/VCR细胞后,不仅仅能增强口腔癌细胞对长春新碱的药物敏感性,而且还抑制了P-gp的表达及功能,使Rho-123在细胞内的蓄积量增加。同时：塞来昔布还能抑制KB/VCR细胞的细胞周期及促进细胞凋亡。尽管COX-2抑制剂在恶性肿瘤防治中的潜力巨大,但长期应用这些药物可能导致心血管、胃肠道方面的风险及出血倾向。因此探求有效抑制COX-2表达及活性的方法,对预防癌症的发生,提高肿瘤化疗敏感性具有重要意义。本研究,我们通过siRNA技术沉默COX-2对KB/VCR细胞的化疗敏感性及调节P-gp/MDR-1表达的关系,探讨siRNA沉默COX-2增强KB/VCR细胞对化疗药物敏感性的作用机制,并研究siRNA沉默COX-2对KB/VCR细胞的侵袭性及增殖产生的影响,为口腔癌的基因沉默治疗提供实验依据。第一章siRNA沉默COX-2基因对P-gp功能的影响。目的研究使用siRNA特异性抑制COX-2基因后能否增强长春新碱对人口腔癌耐长春新碱细胞株KB/VCR的生长抑制作用。方法取对数生长期KB/VCR细胞进行实验。实验分为3组：(1)COX-2siRNA组：用COX-2siRNA转染KB/VCR细胞(2)阴性对照组：用阴性siRNA转染KB/VCR细胞(3)空白对照组：只接种KB/VCR细胞未作任何处理。转染处理48小时后,将COX-2siRNA组细胞、阴性对照组细胞及空白对照组细胞接种于96孔培养板内,进行RT-PCR检测各组细胞COX-2mRNA和MDR-1mRNA的表达。转染处理48小时后,将三组细胞分别接种于6孔培养板内,流式细胞术检测各组细胞内Rho-123的蓄积量。转染处理48小时后,将三组细胞接种于96孔培养板内,MTT法检测细胞活力。结果(1) RT-PCR检测COX-2及MDR-1的mRNA表达。TAE凝胶电泳结果显示在320bp、450bp及600bp附近分别出现条带。根据引物扩增片断长度判断450bp附近条带为MDR-1mRNA片段,COX-2siRNA组条带亮度较阴性对照组及空白对照组明显降低,600bp附近条带为COX-2mRNA片段,COX-2siRNA组条带亮度较阴性对照组及空白对照组明显降低,320bp附近条带为β-actin mRNA片段三组条带亮度相似。COX-2siRNA组细胞中COX-2和MDR-1的mRNA表达明显下调。(2)流式细胞仪检测各组细胞中Rho-123的含量显示,COX-2siRNA组KB/VCR细胞内Rho-123的荧光强度显著高于阴性对照组和空白对照组,表明COX-2siRNA处理后的KB/VCR细胞内Rho-123的蓄积量明显增加。(3)MTT结果显示,COX-2siRNA组细胞的抑制率明显高于阴性对照组和空白对照组,说明COX-2siRNA转染后的KB/VCR细胞对长春新碱的耐受性减弱,COX-2siRNA组的细胞生长抑制率明显高于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义。结论我们成功地将COX-2siRNA导入KB/VCR细胞,并在mRNA水平抑制了COX-2表达。与空白对照组和阴性对照组相比,COX-2siRNA组的KB/VCR细胞的MDR-1基因表达和P-gp的功能都受到了抑制。COX-2siRNA抑制COX-2基因表达与抑制P-gp外排功能(r=0.995,P=0.000)及与抑制MDR-1mRNA表达均呈正相关(r=0.998,P=0.000)。此外COX-2siRNA组的KB/VCR细胞对长春新碱的耐受性减弱,长春新碱对KB/VCR细胞的生长抑制作用明显增强。第二章siRN沉默COX-2基因对口腔癌耐药株KB/VCR细胞的增殖及侵袭的影响目的：观察siRNA沉默口腔癌耐长春新碱细胞株KB/VCR细胞COX-2基因后对KB/VCR细胞增殖及侵袭能力的影响。方法：取对数生长期KB和KB/VCR细胞进行实验。KB细胞接受COX-2siRNA转染。KB/VCR细胞实验分为3组：(1) COX-2siRNA组：用COX-2siRNA转染KB/VCR细胞(2)阴性对照组：用阴性siRNA转染KB/VCR细胞(3)空白对照组：只接种KB/VCR细胞未作任何处理。转染处理48小时后,将三组细胞分别接种于96孔培养板内,采用RT-PCR检测各组细胞COX-2mRNA的表达。转染处理48小时后,将三组细胞分别接种于96孔培养板内,Western blot检测COX-2蛋白的表达。转染处理48小时后,将三组细胞分别接种于96孔培养板内,MTT法检测KB/VCR细胞各组细胞的生长抑制率及COX-2siRNA对KB细胞的生长抑制率。转染处理48小时后,将三组细胞分别接种于6孔培养板内,Transwell小室测定各组细胞的侵袭能力。结果：(1) RT-PCR检测三组细胞中COX-2mRNA表达,TAE凝胶电泳结果显示在320bp及600bp附近分别出现条带。根据引物扩增片断长度判断600bp附近条带为COX-2mRNA片段,COX-2siRNA组条带亮度较阴性对照组及空白对照组明显降低；320bp附近条带为P-actin mRNA片段三组条带亮度相似。COX-2siRNA组中COX-2的mRNA明显下调。(2) Western blot检测COX-2的表达结果显示：COX-2siRNA组的COX-2的表达显著低于阴性对照组及空白对照组的表达,而阴性对照组与空白对照组比较没有显著性差异。(3)MTT结果显示：KB/VCR细胞COX-2siRNA组与阴性对照组和空白对照组比较,其生长抑制率升高,有显著性差异(P<0.01)。阴性对照组与空白对照组相比较没有显著性差异(P>0.01)。 COX-2siRNA对KB/VCR细胞与KB细胞的生长抑制作用没有显著性差异(P>0.01)。(4)Transwell小室检测结果显示：COX-2siRNA组细胞通过聚碳酸酯膜的KB/VCR细胞数较阴性对照组和空白对照组明显减少。COX-2siRNA组细胞与阴性对照组和空白对照组通过聚碳酸酯膜的细胞数分别为：66.667±4.509,127.33±9.609,132.00±8.544。证实COX-2siRNA转染后的KB/VCR细胞侵袭能力明显减弱。结论：COX-2siRNA能特异性沉默KB/VCR细胞的COX-2基因,使KB/VCR细胞生长得到抑制,并减弱其侵袭能力。总之,本研究的体外实验研究结果表明,COX-2siRNA特异性沉默KB/VCR细胞的COX-2基因可以增强长春新碱对KB/VCR细胞的生长抑制作用,这种作用可能与下调KB/VCR细胞P-gp的表达与功能有关。与此同时,COX-2siRNA能特异性沉默KB/VCR细胞的COX-2基因,使KB/VCR细胞生长得到抑制,并减弱其侵袭能力。为进一步理解COX-2在肿瘤细胞多药耐药性的产生及基因沉默增强肿瘤细胞化疗敏感性的机制提供实验依据。