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目的:乳腺癌在女性癌症发病率中排名首位,我国女性乳腺癌的发病率正逐年上升。大多数抗乳腺癌的化疗药物缺乏特异性,对正常组织毒性强。在经历一段时间药物治疗后,癌细胞几乎不可避免的产生耐药,而能够有效治疗耐药癌症的药物罕见。因此,寻找高效低毒、疗效确切的抗乳腺癌靶向治疗药物迫在眉睫。本研究基于近红外荧光染料IR 783为载体以染料木素(Genistein)和FTS为先导化合物,探讨一种新型肿瘤靶向治疗方法。染料木素是广泛存在于自然界中的一种天然黄酮类化合物,其侧链存在多个酚羟基,具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等药理活性,其抗乳腺癌的作用已普遍受到国内外的关注和研究,另一种抗肿瘤药物FTS,是RAS抑制剂,具有广谱抗癌活性,也是抗乳腺癌的潜在治疗药物。但其水溶性差,靶向性差,已成为了临床开发运用的主要障碍。有研究报道,近红外荧光染料IR 783能特异性在癌细胞中聚集,并具有靶向载体的作用,将药物直接输送到肿瘤。因此,本研究将IR-783与Genistein和FTS相结合,利用IR 783将Genistein和FTS携带进入肿瘤细胞或组织,从而增强两者的肿瘤靶向性,为靶向肿瘤抗癌药物的开发和研究提供数据基础和理论依据。方法:1.靶向性Genistein-IR 783和FTS-IR 783衍生物的合成以近红外荧光染料IR 783为载体,将Genistein和FTS与之相结合。首先通过色谱柱分离纯化,结合UV-VIS近红外荧光、HPLC、NMR和MS等方法验证IR 783与Genistein和FTS成功连接。2.靶向性Genistein-IR 783和FTS-IR 783衍生物对细胞活性的影响选用人乳腺癌细胞MCF 7、LTED(一种内分泌治疗的耐药乳腺癌模型)和人正常乳腺细胞MCF 10A为体外细胞模型。采用细胞计数仪检测Genistein(浓度为5、10、25、50 和 75 μM)和 Genistein-IR 783 衍生物(浓度为 5、10、25、50 和 75μM)作用72 h后对MCF 7、MCF 10A细胞活性的影响。采用细胞计数仪检测FTS(浓度为5、10、25、50和75μM)、IR 783(浓度为 5、10、25、50 和 75 μM)和FTS-IR783衍生物(浓度为5、10、25、50和75 μM)作用72 h后对MCF7、MCF 10A和LTED细胞活性的影响。采用ELISA测定不同浓度FTS-IR 783诱导MCF 7细胞和LTED细胞凋亡的作用。3.靶向性Genistein-IR 783和FTS-IR 783衍生物对细胞的摄取情况采用LI-COR扫描仪测定新化合物Genistein-IR 783衍生物(浓度为5、10、25、50 和 75μM)和 FTS-IR 783 衍生物(浓度为 5、10、25、50 和 75μM)在 MCF 7、MCF 10A和LTED细胞中的荧光强度;荧光共聚焦显微镜观察Genistein-IR 783衍生物在MCF 7和MCF 10A细胞中的分布;采用流式细胞术观察新化合物Genistein-IR 783衍生物在MCF 7细胞中摄取的时间依赖性和摄取途径;荧光共聚焦显微镜观察活MCF 7细胞摄取Genistein-IR 783衍生物的动态变化。4.靶向性Genistein-IR 783衍生物在细胞中的定位采用荧光共聚焦显微镜考察Genistein-IR 783衍生物(50μM)在MCF 7细胞中的定位。5.靶向性Genistein-IR783和FTS-IR 783衍生物体内靶向肿瘤的作用以接种MCF 7细胞的裸鼠为体内模型,采用小动物活体成像仪(IVIS)观察Genistein-IR 783和FTS-IR 783衍生物在肿瘤及正常器官的分布和聚积。采用荧光共聚焦显微镜观察肿瘤组织中Genistein-IR 783衍生物的荧光摄取情况。6.统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行数据分析;采用GraphPad 5.0数据分析软件进行作图,数据以均数±标准差(Mean ± SD)表示,P<0.05表示具有显著学差异。结果:1.靶向性Genistein-IR 783和FTS-IR 783衍生物的合成已成功将Genistein和FTS分别与IR-783相连接,得到新化合物Genistein-IR 783衍生物和FTS-IR 783衍生物。2.靶向性Genistein-IR783和FTS-IR 783衍生物对细胞活性的影响Genistein-IR 783 衍生物(IC50=10.4± 1.0μM)与 Genistein(IC50=24.8±0.3μM)相比,对MCF 7细胞活性有显著抑制作用,对MCF 10A细胞活性抑制无显著性。FTS-IR 783衍生物对MCF 10A细胞活性无显著影响,对MCF 7和LTED细胞活性抑制作用显著。LTED细胞对FTS-IR 783衍生物的高度敏感性提示该药有可能用于在内分泌治疗失败后复发的雌激素依赖性乳腺癌的治疗。低浓度FTS-IR 783(25 μM)诱导LTED细胞凋亡,而同样剂量的FTS和IR-783则无效。FTS-IR 783同时也诱导MCF 7细胞凋亡。3.靶向性Genistein-IR783和FTS-IR 783衍生物对细胞的摄取情况LI-COR观察荧光强度,发现在MCF 10A细胞中,随着浓度的增加Genistein-IR 783衍生物未显著改变胞内荧光强度,但在MCF 7细胞中,随着浓度的增加Genistein-IR 783衍生物显著增加胞内荧光强度,呈浓度依赖性。预先使用OATP抑制剂BSP孵育后,与未加BSP组相比,在MCF 7细胞中中,加BSP组显著抑制了 Genistein-IR 783衍生物在细胞中约40%(P<0.05)的摄取;在MCF 10A细胞中,加BSP组显著抑制了 Genistein-IR 783衍生物在细胞中约15%的摄取。预先使用3种不同内吞作用抑制剂孵育后,与对照组相比,在MCF 7细胞中,阿米洛利导致Genistien-IR 783衍生物在细胞中的荧光强度减少约40%(P<0.05),β-环糊精和氯丙嗪导致Genistien-IR 783衍生物在细胞中的荧光强度减少20-30%(P<0.05)。结果表明Genistein-IR 783衍生物对MCF 7细胞具有靶向性,对MCF 10A细胞无显著影响,及Genistein-IR 783衍生物在细胞中的摄取途径与OATP和胞饮途径相关。在MCF 10A细胞中,FTS-IR 783衍生物未显著改变胞内荧光强度,但在MCF 7细胞中,FTS-IR 783衍生物显著增加胞内荧光强度,呈浓度依赖性。结果表明FTS-IR 783衍生物对MCF 7细胞具有靶向作用,对MCF 1OA细胞无显著影响。4.靶向性Genistein-IR783衍生物定位于胞浆中经荧光共聚焦显微镜观察到Genistein-IR 783衍生物在MCF 7细胞内外存在红色荧光(Cy7),结果表明Genistein-IR 783衍生物定位于胞浆中。5.靶向性Genistein-IR783和FTS-IR783衍生物体内靶向肿瘤的作用通过IVIS扫描近红外荧光,观察到近红外荧光主要聚集动物的肿瘤部分。结果表明Genistein-IR 783衍生物和FTS-IR 783衍生物能够特异性地靶向肿瘤。结论:本实验中,我们以近红外荧光染料IR 783为载体,成功将Genistein和FTS分别与IR-783相连接,得到新化合物Genistein-IR 783衍生物与FTS-IR783衍生物。通过体外实验,发现Genistein-IR 783衍生物和FTS-IR 783衍生物可显著抑制人乳腺癌细胞MCF 7的活性,对人正常乳腺细胞MCF 10A无显著影响,并发现FTS-IR 783衍生物对雌激素剥夺的LTED细胞抑制作用显著。通过体内成像实验,发现Genistein-IR 783和FTS-IR 783可在肿瘤组织中蓄积,具有肿瘤靶向性。综上,本实验结果将为靶向肿瘤抗癌药物的开发和研究提供数据基础和理论依据。