论文部分内容阅读
目的:肿瘤的复发和转移主要是因机体的抗肿瘤免疫功能低下而产生的,表现为免疫逃逸和免疫耐受;肿瘤疫苗通过增强肿瘤的抗原性而重建机体的免疫功能,已成为肿瘤防治的一种新疗法,而将hGM-CSF基因转入肿瘤细胞可使细胞的免疫原性大大增加。本实验通过HA纳米颗粒携带hGM-CSF基因进行转染,制备成转hGM-CSF基因的HepG2疫苗,体外观察转基因HepG2疫苗的抗瘤效应,为基因修饰的肝癌疫苗的临床应用奠定基础。方法:1.转基因的HepG2细胞疫苗的制备与鉴定:HA纳米载体携GM-CSF基因转染HepG2细胞,RT-PCR方法检测GM-CSF基因mRNA的表达,采用ELISA法检测hGM-CSF蛋白的分泌,再将其经亚致死剂量的放射线后,制备成携带hGM-CSF基因的HepG2细胞疫苗。同时制备野生型HepG2疫苗。2.外周血单个核细胞PBMC的分离与诱导:取健康人外周血,密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞(PBMC),分别与不同浓度的转基因HepG2疫苗及野生型HepG2疫苗共同培养,筛选最佳诱导浓度。3.PBMC分组:根据诱导细胞的不同将PBMC分为五组,转基因HepG2疫苗组、野生型HepG2疫苗组A、野生型HepG2疫苗组B、空白对照组A、空白对照组B,其中野生型HepG2疫苗组A为单纯的野生型HepG2疫苗诱导,野生型HepG2疫苗组B为野生型HepG2疫苗加hGMCSF因子诱导;空白对照组A、空白对照组B加等量培养基,在IL-2存在或不存在的条件下共同培养。4.各组PBMC体外抗瘤效应的观察:选择最佳诱导浓度,各组PBMC在诱导后,流式细胞术分析CD4+、CD8+细胞比例的变化,ELISA法测定INF-γ的分泌,WST法测定各组PBMC的杀伤活性。结果:1.成功制备转基因的HepG2细胞疫苗和野生型HepG2疫苗。RT-PCR显示hGM-CSF基因在HepG2细胞中已整合及稳定表达。ELISA检测出转入hGM-CSF基因的HepG2细胞能稳定分泌hGM-CSF,其分泌量为197.28±38.53ng/10E6cells每24 h。2.成功分离PBMC,经台盼蓝染色细胞活性均在95%以上。在I:E值为1:20时,转基因HepG2疫苗和野生型HepG2疫苗诱导PBMC增殖的能力均有最大效应(P<0.05)。3.I:E值为1:20时,流式细胞结果显示转基因HepG2疫苗组PBMC中CD4+百分率为57.49±0.98%,CD8+细胞百分率为39.06±2.01; ELISA结果显示转基因HepG2疫苗组PBMC中INF-γ分泌量为1989.76±254.21pg/ml;WST结果显示转基因HepG2疫苗组PBMC在不同的效靶比的条件下对HepG2的杀伤率分别为55.32±6.29、64.85±7.31和79.37±6.02,均高于其他各组(野生型HepG2疫苗组A、野生型HepG2疫苗组B、空白对照组A、空白对照组B )PBMC(P<0.05)结论:1.运用HA纳米载体可以安全的将目的基因hGM-CSF导入肝癌细胞中且获得稳定表达,成功制备成转hGM-CSF基因的HepG2细胞疫苗。2.转hGMCSF基因HepG2细胞疫苗能有效诱导PBMC的增殖、分化和杀伤效应,有望成为治疗和预防HCC复发的新手段。