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QO-58是新开发的吡唑并嘧啶酮类钾通道开放剂,对钠通道有抑制作用,药效学初步研究提示其有抗惊厥、抗癫痫和镇痛等作用。QO-58原药水溶性较差,为提高其溶解性,制成了赖氨酸盐即QO-58lysine。为了评价QO-58lysine盐的临床前安全性,本研究将进行其长期毒性试验及相伴毒代动力学研究,为进一步开发成新药提供实验依据。第一部分QO-58lysine盐大鼠长期毒性研究目的:观察连续灌胃给予SD大鼠QO-58lysine盐化合物4周的长期毒性反应,为进一步的研发工作提供参考。方法:SD大鼠80只,6-7周龄,体重180~220g,雌雄各半,试验前适应性饲养和检疫1周。试验时按性别、体重随机分成4组,每组20只,雌雄分笼饲养。供试品分成小、中、大三个剂量组,分别为66、200、600mg/kg,对照组给予0.5%的CMC-Na溶媒。以上动物全部灌胃给药,灌胃容积为2ml/100g体重,每日给药1次,每周给药7天,连续4周。给药期间,每日观察动物外观体征、行为活动,每周测量一次体重、摄食量并计算摄食量/体重。末次给药后24h各组剖杀12只动物(雌雄各半),观察各组给药后血液学指标及血液生化指标的变化,并进行大体解剖和组织病理学检查,对心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、肾上腺、胸腺、睾丸、附睾、子宫、卵巢、脑等进行剥离称重并计算脏器系数,停药恢复2周后,各组剖杀剩余动物,进行上述检查。试验数据的处理和统计分析采用Excel2003和SPSS 13.0软件。结果:1一般观察:QO-58lysine盐连续给药4周及停药恢复2周,动物外观体征、行为活动与溶媒对照组基本一致;给药4周内及停药2周后,各剂量组体重、摄食量和摄食量/体重与对照组相比均无明显差异。2血液学检查:QO-58lysine盐小、中、大剂量连续给药4周,与对照组相比,小剂量组单核细胞百分比(MO%)和凝血酶原时间(PT)明显升高(P<0.05),红细胞平均血红蛋白(MCH)明显降低(P<0.05),停药2周后,MO%仍偏高(P<0.05),其他参数恢复正常;中剂量组各项指标无显著差异(P>0.05);大剂量组MO%和PT明显升高(P<0.05),恢复2周中性粒细胞百分比(NE%)明显降低(P<0.05)和血小板计数(PLT)明显增大(P<0.05)。由于MO的升高有剂量依赖关系,提示动物可能伴有炎症反应。3血液生化学检查:QO-58lysine盐小、中、大剂量连续给药4周,与对照组相比,小剂量组总胆红素(T-BIL)显著升高(P<0.01)、白蛋白(ALB)降低(P<0.05);中剂量组天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、血清钾离子(K+)浓度、氯离子(Cl-)浓度明显降低(P<0.05或0.01),T-BIL、血糖(GLU)明显升高(P<0.01,P<0.05);大剂量组T-BIL明显升高(P<0.01),CK明显降低(P<0.05),其它指标无显著性改变。停药2周后,小、中、大三个剂量组生化指示基本恢复正常,仅AST、CK有显著降低(P<0.05),这种改变认为无生物学意义。4脏器重量及脏器系数:QO-58lysine盐小、中、大剂量连续给药4周后,各剂量组各脏器重量与对照组相比无明显差异,仅大剂量组雄性动物脾脏重量系数明显降低(P<0.05)。停药2周后,与对照组相比,小剂量组雌性动物肾脏重量明显减少(P<0.05),中剂量组雄性动物肾上腺重量明显增加(P<0.05),大剂量组雄性动物心脏重量明显增加(P<0.05)和雌性动物脾脏重量明显增加(P<0.05);小剂量组雄性动物心脏重量系数明显减小(P<0.05),大剂量组雌性动物脾脏重量系数明显增高(P<0.05)。5病理学检查结果:QO-58lysine盐小、中、大剂量连续给药4周后,对照组动物出现不同程度气管和肺炎细胞浸润、脾脏髓外造血,个别出现肝脏、心脏和肾脏的病变。给药组大鼠小、中、大三个剂量组也均出现脾脏髓外造血(58.3%-83.3%),气管炎细胞浸润(58.3%-91.7%),肺部支气管炎性改变(25%-58.3%),从发生率和发生的程度上与对照比较没有明显差别。停药2周后,上述病变均已减轻或消失。由于上述改变亦见于对照组,且无剂量依赖关系,认为可能与给药操作有关,均非药物因素所致。结论:QO-58lysine盐连续给药4周,各组均出现气管、肺的炎性变化,认为可能与灌胃操作有关,未见明显的药源性毒性发现。但给药组出现的总胆红素呈剂量依赖性升高和心脏重量增大,提示在以后的研究中需要引起注意。第二部分QO-58lysine盐大鼠相伴毒代动力学研究目的:研究SD大鼠单次及多次(4周)灌胃给予QO-58lyine盐化合物的毒代动力学,分析机体血药浓度变化规律及体内蓄积分布情况。方法:1 SD大鼠80只,6-7周龄,体重180~220g,雌雄各半,试验前适应性饲养和检疫1周以确保无异常。试验时按性别、体重随机分成4组,各组均为20只,雌雄分笼饲养。给药剂量及给药方式与长期毒性试验一致。给药第一天,每组随机取10只大鼠(雌雄各半)做单次毒代动力学,在给药前(0h)及药后1 h、5 h、10 h、15 h、24h、48h共7个时间点采用内眦连续取血。取完最后一个点的血后剖杀并取主要脏器:心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、胃脏、肌肉、脑、脂肪、膀胱、睾丸和子宫,匀浆后测各组织中药物是否仍有分布。剩下的40只大鼠,与长期毒性试验同期连续灌胃给药4周。末次给药前(0h)及药后1 h、5 h、10 h、15 h、24h、48h共7个时间点采用内眦连续取血。取完最后一个点的血后剖杀取主要脏器:心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、胃脏、肌肉、脑、脂肪、膀胱、睾丸和子宫,匀浆测各组织中药物是否仍有分布。2采用HPLC-MS/MS法测QO-58lysine盐血药浓度。LC条件:Phenomenex C18色谱柱(50×2.0 mm,3μm),柱温为35℃,流动相为乙腈-10m M乙酸铵水溶液(53:47),流速为0.3m L·min-1,进样量为5μL;MS条件:电喷雾离子源,正离子电离模式,多反应离子监测的MS扫描方式。运用DAS3.2.6软件计算AUC0-48、Cmax、Tmax等毒代动力学参数。结果:1 QO-58lysine盐血药浓度线性范围为0.05~250mg/L,标准曲线为Y=135000X-211(r=0.9959),最低定量限为0.05mg/L;低浓度(0.1 mg/L)的日内和日间精密度良好,RSD均小于20%,准确度在±15%以内,中浓度(25 mg/L)和高浓度(250 mg/L)的日内和日间精密度RSD均小于15%,准确度均在±15%以内;基质效应和回收率均符合要求;其常温放置2h、-20℃储存15日及反复冻融3次的稳定性良好。2动物性别对药物峰浓度(Cmax)和药时曲线下面积(AUC)无明显影响,雌雄差别不明显。各剂量组AUC与给药剂量呈线性相关。多次给药的Cmax和AUC0-48比单次给药的低,Tmax与单次给药相比缩短。48h的组织浓度分布结果显示,药物主要残留于肝和肾,其它主要脏器停药48h后未见明显残留。结论:本试验第一次用HPLC-MS/MS法测定了QO-58lysine盐的毒代参数,该方法专属性强、灵敏度高、操作简便。QO-58lysine盐比QO-58原药相近剂量下的Cmax和AUC均明显增大,说明QO-58lysine盐经口给药比原药吸收更好。单次给药毒代参数与多次给药毒代参数有所不同,提示药物可能对肝脏代谢酶有影响。从毒代组织分布结果和给药剂量与AUC线性相关的结果分析,该药物没有引起体内蓄积现象。