论文部分内容阅读
Notch是一个跨膜受体。Notch受体通过与膜上配体的相互作用而被激活，在哺乳类其配体特指Jagged／Delta。Notch受体至少含有三个位点（S1-S3），在此位点蛋白水解酶使跨膜受体裂解。在成熟期间，300 kDa的蛋白前体在S1位点被Furine样的转化酶所裂解。Notch受体一配体的相互作用诱导进一步分离，首先在S2位点排除Notch受体细胞外部分（Notch extracellular domain，NEC），然后在S3位点释放Notch受体细胞内部分（Notch intracellular domain，Notch-IC）。分离以后，Notch-IC就转移进入核内，与RBP-J（在哺乳动物中又称CBFl）相互作用并调节基因的表达。在哺乳动物中已有4个Notch基因（Notch1，Notch2，Notch3和Notch4）被描述，它们编码只有单一跨膜区的受体。几个哺乳类动物的靶基因通过Notch-IC和RBP-J／CBF1的相互作用而被诱导，像HES or Hes（the hairy enhancer of split）和HRT or Hey（hairy-related transcription factor，Hairy相关转录因子）。EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）通过引起B淋巴细胞潜伏感染，在人类建立了终生持续型感染状态，并可以导致淋巴细胞性及上皮性恶性肿瘤。近来研究显示，EBV感染的B淋巴细胞永生化依赖于病毒携带的一个B淋巴细胞转化基本调节因子EBNA2（EB病毒核心抗原2）。尽管在基因序列上没有相关性，Notch受体和EBNA2却共同具有一些生化和功能上的特性，例如都相互作用于Notch信号通路上的核心因子，RBP-J kappa（又称CBF1）。然而，在调节下游信号通路基因表达方面，Notch与EBNA2相互关系还不清楚。本研究选择Notch2受体和EBNA2基因为目标，应用HeLa细胞和Cos7细胞与不同的载体瞬间联合转染，实时定量反转录-PCR（QRTPCR），CBF1和HES1启动子荧光素酶分析及Notch2-RNAi干扰技术，探讨Notch2-IC与EBNA2相互作用关系。在现有的研究中，我们发现过度表达的Notch2-IC或EBNA2载体可以明显上调CBF1启动子表达，CBF1启动子突变后（3XMT），N2IC则完全丧失对CBF1启动子的上调作用，而EBNA2则部分丧失对CBF1启动子的上调作用，说明由Notch-IC和EBNA2调节的启动子系列有重叠但不等同。同时研究结果显示，N2IC和EBNA2均能有效地激活HES1启动子活性表达，说明Notch与EBNA2可以共同作用于Notch基因家族的下游信号通路。令人感兴趣的是，Notch2-RNAi（干扰Notch2使无其活性）可以削弱EBNA2介导的CBF1和HES1表达。我们的结果证实，在EBNA2介导的信号通路中，活化的Notch2起关键性作用，提示Notch信号（尤其内源性Notch）可能参与EBV感染过程中EBNA2调节。第二部分Notch1与Notch2受体在控制血管平滑肌细胞生长过程中的相反作用：HES1的调节作用Notch受体家族在决定细胞的最终命运及血管形成方面起重要作用。Notch受体与配体混合物存在的多样性表明每个Notch受体可能具有不同的作用。在这里，我们报道了Notch-1与Notch-2在血管平滑肌细胞生长调节过程中新的作用机制。实验方法包括：用不同血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cell，VSMC）与不同的载体瞬间联合转染，实时定量反转录-PCR（QRTPCR），[3H]脱氧胸腺嘧啶核苷接合实验，蛋白质印迹（Western blotting），人p27KIPI启动子荧光素酶分析，染色质免疫沉淀（ChIP）及HES1-RNAi干扰技术。同时构建了A7r5（胚胎期大鼠主动脉平滑肌细胞）稳定表达Notch1-IC和Notch2-IC细胞株及人p27KIPI启动子荧光素酶-HES1结合位点定点突变载体。我们观察到，Notch-1细胞内与激活相关的关键区（N1-IC）高表达可通过提高细胞周期抑制剂p27KIPI的表达，从而抑制血管平滑肌细胞生长。相反，Notch-2细胞内与激活相关的关键区（N2-IC）则表现为刺激血管平滑肌生长及诱导p27KIPI表达水平降低。p27KIPI启动子5′端大约3.5kb的启动子区域基因删除图谱分析结果表明：存在于-774与-549bp之间区域的cis-物质对N1-IC与N2-IC参与的p27KIPI转录激活的不同的调节作用起关键作用，并且此区域包含有假定的HES1联结区，实际上N1-IC对HES1的表达起上调作用，N2-IC则无此作用。而且，HES1在N1-IC与N2-IC参与的p27KIPI基因转录的不同反应中起重要的调节作用。此作用已经通过一系列的实验得到了验证，包括直接定位点突变和染色质免疫沉淀及RNAi对HES1的基因干扰作用。更进一步，干扰HES1基因会引起N1-IC诱导的生长抑制作用与N2-IC刺激的平滑肌生长作用得到潜在性的削弱。以上结果表明：Notch-1与Notch-2受体分别调控众多与Notch转录关联的HES1的重要下游转录因子中的一个效应基因，因此，在平滑肌生长调节中起完全相反的作用。