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变态发育是昆虫发育中最具特色和最为重要的现象,也是昆虫对外界环境长期适应进化的结果。根据发育过程中是否存在蛹期把昆虫分为完全变态与不完全变态两大类。完全变态昆虫被认为是昆虫纲中进化程度最高的一群,其一生要经历卵、幼虫、蛹和成虫4个阶段。通常完全变态昆虫的成虫形态和大小是由蛹个体长度大小来决定的。然而,哪些因素影响了昆虫蛹体长度的大小呢?已有的研究发现蛹体长度大小的形成涉及一系列的基因表达、网络调控和激素调节,其发育调控机制极其复杂。目前,人们对于这一机制的了解还只是冰山一角,特别是miRNA如何调控昆虫蛹期发育更是知之甚少。miRNA是一类21～24nt的非编码小RNA,其通过调控靶基因的转录后表达水平发挥生物学功能。由于成熟miRNA的片段较短以及靶基因众多等特点导致目前对miRNA确切的和多样化的功能研究较为困难,因此利用生物信息学和分子生物学实验相结合方法对miRNA调控昆虫蛹体长度大小进行深入研究,不仅对深刻揭示miRNA在昆虫变态发育中的调控机制具有重要的理论意义,而且对农业昆虫的防治也具有重要的实践价值。黑腹果蝇是完全变态昆虫同时也是经典的模式生物,因此本论文选取黑腹果蝇为研究对象,对miRNA调控黑腹果蝇的蛹体长度大小进行研究。分析黑腹果蝇miRNA的表达谱,发现miR-11在三龄幼虫后期到预蛹期均出现表达量的增加,而在其它阶段表达量较低。进一步对miR-11所属家族进化分析发现miR-11只在完全变态昆虫中保守,而不完全变态昆虫中没有发现miR-11的存在,这些结果暗示miR-11可能参与了黑腹果蝇蛹期发育调控。为了验证这一假设,论文进行了以下研究:1.利用RMCE技术和Gal4/UAS系统构建了 miR-11的敲除或缺失品系以及miR-11的过表达品系,并且对miR-11突变品系进行表型观察,发现miR-11的敲除或功能性缺失突变体品系会导致黑腹果蝇蛹体长度和重量均变大,而miR-11全身过表达品系则出现蛹期致死。对一龄幼虫、二龄幼虫、三龄幼虫、蛹和成虫五个不同发育阶段表型观察及体长测量排除了发育延迟导致蛹变长的可能,同时发现miR-11的敲除会导致蛹和雌雄成虫的体长均出现增长,而幼虫期的miR-11敲除品系与野生型相比没有显著性差异。敲除或者抑制miR-11活性能够使黑腹果蝇在变态过程中形成体长较大的蛹,暗示miR-11可能参与了黑腹果蝇蛹体长度大小的调控。2.为了揭示miR-11调控黑腹果蝇的蛹体长大小的机制,利用生物信息学技术对miR-11的189个靶基因进行信号通路富集性分析,发现这些靶基因主要涉及Ras/MAPK信号通路,并且miR-11能够靶向Ras/MAPK通路中的Ras85D和Sos基因。进一步对miR-11与Ras85D、Sos基因的靶标关系进行体内和体外验证,发现miR-11能够作用Ras85D基因的3’UTR区域,而无法靶向Sos基因的3’UTR区域,表明miR-11可能是通过靶向Ras85D基因来调控蛹体长度大小。3.为了证明是否miR-11直接靶向Ras85D来调控蛹体长度大小的形成,对靶基因Ras85D在miR-11诱导的蛹缺陷表型中的作用进行了研究。我们运用基础遗传学方法构建双突变体:同时敲除miR-11和抑制的Ras85D的功能品系,发现双突变株能够挽救了 miR-11敲除株的表型缺陷。对Ras85D和miR-11的时间表达模式分析,发现miR-11和Ras85D的表达量在化蛹以后的呈现此消彼长表达模式。这些结果表明miR-11在整个变态发育过程中抑制Ras85D的表达,并且通过直接靶向Ras85D调控蛹体长度大小的形成。综上所述,我们利用生物信息学结合分子生物学实验的有效手段,证明了黑腹果蝇miR-11可以通过直接靶向Ras85D的3’UTR进而调控蛹体长度大小的形成,最终参与了蛹期变态发育的调控。论文结果为miRNA调控昆虫变态发育提供了有力的和切实的实验证据;为深入揭示昆虫变态发育的调控机制提供了新视角和有益的启示;生物信息学和分子生物学技术相结合的手段能有效地发现miRNA的靶基因和功能,这为进一步研究miRNA的潜在功能提供了新的研究策略;揭示miR-11调控昆虫变态发育的机制将对于农业害虫防治也具有深远意义。