论文一ARAP2调控雄激素受体介导的基因转录及其在前列腺癌中的作用和机制　　目的：　　前列腺癌是流行性位居世界第二位的男性恶性肿瘤和男性患肿瘤致死的主要因素之一。雄激素剥夺疗法是治疗晚期前列腺癌的主要方法，但多数患者复发肿瘤并转向难治愈的去势抵抗阶段和产生药物抵抗。在前列腺癌发生发展的各个阶段，雄激素受体(AR)的信号始终具有活性并在去势抵抗前列腺癌的发展中起到重要的作用。研究发现在去势抵抗前列腺癌中存在着大量的缺乏AR配体结合区(LBD)的AR突变体(AR-Vs)，这些突变体与去势抵抗前列腺癌的进展以及对抗癌药物的抵抗存在重要的作用。许多AR辅转录调节因子被鉴定参与前列腺癌的进展，它们中的很多属于E3泛素连接酶家族。ARAP2是一个含有RING指基序的E3泛素连接酶，主要功能是传递DNA双链断裂(DSBs)的DNA损伤信号，并调节赖氨酸-48和赖氨酸-63的多泛素化以及组蛋白H2A和H2B的单泛素化修饰。在基因转录调控方面，ARAP2上调核受体RXRα介导的基因转录，另外在DSBs环境中通过调节H2A泛素化参与基因转录沉默。ARAP2基因缺陷小鼠患多种肿瘤，提示了ARAP2在肿瘤形成中的重要作用。在这项研究中，我们的目的旨在鉴定ARAP2是否调控核受体AR和AR-Vs介导的基因转录及其调控机制，以及ARAP2是否影响前列腺癌和去势抵抗前列腺癌的增殖和/或迁移，为研发前列腺癌及去势抵抗前列腺癌治疗方法提供新靶点。　　方法：　　一、ARAP2在前列腺癌组织细胞中的表达情况　　1、免疫组化实验检测ARAP2在正常前列腺组织及前列腺癌组织切片中的表达模式及表达水平并统计检测结果。　　2、Western Blot检测ARAP2在不同前列腺癌细胞中的表达水平。　　二、ARAP2调控AR介导基因转录　　1、应用双报告基因检测实验检测在缺乏雄激素或加入雄激素环境中ARAP2对AR介导基因转录的调控。　　2、应用双报告基因检测实验检测在缺乏雄激素环境不同剂量ARAP2对AR介导基因转录的调控作用。　　3、双报告基因检测实验检测在缺乏雄激素环境下ARAP2在前列腺癌细胞中对内源性AR介导基因转录的调控作用。　　4、应用双报告基因检测实验检测ARAP2对AR两个重要功能域AF1和AF2介导基因转录的调控作用。　　5、Realtime PCR检测ARAP2对AR靶基因转录水平的调控。　　三、ARAP2两个功能域FHA结构域和RING指基序在调控AR介导基因转录中的作用　　1、构建含Flag标签的表达质粒ARAP2野生型(Flag-ARAP2)、FHA结构域缺失型(Flag-ARAP2△FHA)和RING指基序缺失型（Flag-ARAP2△RING）。　　2、细胞免疫荧光实验检测ARAP2与AR细胞内共定位，以及ARAP2两个功能域FHA和RING对二者共定位的影响。　　3、co-IP实验检测ARAP2与AR的细胞内相互作用，以及ARAP2两个功能域FHA和RING对二者相互作用的影响。　　4、应用双报告基因检测实验检测ARAP2两个结构域的缺失分别对ARAP2调控AR介导基因转录的影响。　　四、ARAP2参与调控AR-Vs（AR-V7）介导基因转录　　1、应用双报告基因检测实验检测在缺乏雄激素环境中ARAP2对去势抵抗前列腺癌细胞内源AR-Vs介导基因转录的调控作用。　　2、细胞免疫荧光实验检测在缺乏雄激素环境中去势抵抗前列腺癌细胞内源ARAP2与AR-Vs细胞内共定位。　　3、co-IP实验检测在缺乏雄激素环境中去势抵抗前列腺癌细胞内源ARAP2与AR-Vs的细胞内相互作用。　　4、细胞免疫荧光实验检测在缺乏雄激素环境中ARAP2与AR-Vs之一的AR-V7细胞内共定位。　　5、co-IP实验检测在缺乏雄激素环境中ARAP2与AR-V7的细胞内相互作用。　　6、应用双报告基因检测实验检测在缺乏雄激素环境中ARAP2对AR-V7介导基因转录的调控作用。　　五、干扰ARAP2表达(siRNA)减少AR靶基因启动子区组蛋白H2A和H2B泛素化水平　　1、ChIP实验检测AREs区(KLK2启动子)受ARAP2影响的组蛋白修饰。　　2、ChIP re-IP实验检测ARAP2与AR是否形成复合物共同募集在AREs(KLK2启动子)。　　3、co-IP实验检测AR、ARAP2和MOF是否形成复合物。　　4、双报告基因检测实验检测ARAP2和MOF是否协同调节AR介导基因转录。　　六、ARAP2调节前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭　　1、细胞克隆形成实验和细胞计数实验检测ARAP2对前列腺癌细胞增殖的影响。　　2、荷瘤小鼠实验检测ARAP2是否在体内影响前列腺癌细胞成瘤及肿瘤生长。　　3、Transwell实验检测ARAP2对前列腺癌细胞迁移和侵袭的影响。　　结果：　　一、ARAP2在前列腺癌组织细胞中的表达情况　　1、与正常前列腺组织相比，ARAP2在前列腺癌组织中表达水平升高并且随着格林森评分的增大而升高。　　2、ARAP2主要表达于AR阳性前列腺癌细胞，并且在去势抵抗前列腺癌细胞中的表达量高于激素敏感前列腺癌细胞。　　二、ARAP2调控AR介导基因转录　　1、过表达ARAP2在缺乏雄激素时上调AR介导的基因转录，雄激素的加入增强ARAP2对AR介导基因转录的上调作用。　　2、ARAP2在缺乏雄激素时以剂量依赖的方式上调AR介导的基因转录。　　3、沉默ARAP2在缺乏雄激素时减弱前列腺癌细胞中内源AR介导的基因转录。　　4、过表达ARAP2对激素非依赖的ARAF1上调作用更强于其对AR全长的上调作用。　　5、ARAP2的缺失降低AR某些靶基因的转录水平。　　三、ARAP2两个功能域FHA结构域和RING指基序在调控AR介导基因转录中的作用　　1、雄激素存在情况下ARAP2与AR共定位在细胞核，ARAP2的FHA结构域的缺失阻碍其与AR在细胞核内共定位。　　2、ARAP2与AR存在细胞内相互作用，雄激素增强二者相互作用。FHA结构域的缺失阻碍二者相互作用。　　3、FHA结构域和RING指基序的缺失都减弱ARAP2对AR介导基因转录的上调作用。　　四、ARAP2参与调控AR-Vs(AR-V7)介导基因转录　　1、ARAP2在缺乏雄激素环境中增强去势抵抗前列腺癌细胞内源AR-Vs介导的基因转录。　　2、在缺乏雄激素环境中，去势抵抗前列腺癌细胞内源ARAP2和AR-Vs共定位在细胞核。　　3、在缺乏雄激素环境中，去势抵抗前列腺癌细胞内源ARAP2和AR-Vs存在细胞内相互作用。　　4、ARAP2在缺乏雄激素环境中与AR-V7共定位在细胞核。　　5、ARAP2在缺乏雄激素环境中与AR-V7存在细胞内相互作用。　　6、ARAP2在缺乏雄激素环境中增强AR-V7介导的基因转录。　　五、干扰ARAP2表达(siRNA)减少AR靶基因启动子区组蛋白H2A和H2B泛素化水平　　1、ARAP2的缺失减弱AREs区(KLK2启动子)组蛋白H2A和H2B的泛素化以及H4K16乙酰化水平。　　2、ARAP2与AR以复合物形式共同募集在AREs(KLK2启动子)上。　　3、AR、ARAP2和MOF形成复合物且依赖ARAP2的存在。　　5、ARAP2和MOF协同上调AR介导的基因转录。　　六、ARAP2调节前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭　　1、ARAP2的缺失抑制激素敏感前列腺癌细胞LNCaP及去势抵抗前列腺癌细胞22Rv1的生长。　　2、ARAP2的缺失抑制NOD/SCID小鼠体内去势抵抗前列腺癌细胞22Rv1细胞肿瘤移植物的生长。　　3、ARAP2的缺失减弱去势抵抗前列腺癌细胞22Rv1的迁移和侵袭能力。　　结论：　　1、ARAP2增强AR介导的基因转录并促进AR某些靶基因的转录，该作用依赖ARAP2的FHA结构域和RING指基序的完整。　　2、ARAP2在缺乏雄激素环境中促进AR-Vs(AR-V7)介导的基因转录。　　3、ARAP2与AR形成复合物共同募集在AREs，促进组蛋白H2A和H2B泛素化，并与MOF催化的H4K16乙酰化交互对话调控AR介导的基因转录。　　4、ARAP2促进前列腺癌及去势抵抗前列腺癌细胞的生长和迁移。　　论文二鉴定活化SXR介导CYP3A和CYP7A1转录活性的内分泌干扰化合物　　目的：　　内分泌干扰化合物(Endocrine disrupting chemicals，EDCs)对激素正常生理代谢平衡具有潜在的干扰作用，这使其成为公共卫生领域关注的主要问题之一。在外源化合物如EDCs的刺激下，类固醇异生物受体(steroid xenobiotic receptor,SXR)或NR1I2与SXR反应元件(SXR response element)结合调节CYP3A基因的表达。我们通过双报告基因检测法检测了55种EDCs，其中14种均能够同等水平增强SXR介导的大鼠和人CYP3A基因的转录，并且这14种EDCs还能通过SXR与LXRα反应元件（LXRαresponse element，LXRE）相互作用来活化大鼠CYP7A1基因转录。无配体情况下SXR在细胞核中呈弥散状态，而当SXR与配体结合后其在细胞核内呈点状存在。另一方面，这14种阳性EDCs也可以进一步增强内源CYP3A4 mRNA的转录。我们的研究为EDCs干扰SXR介导的类固醇或异生物代谢平衡提供一个可能的机制。　　方法：　　一、鉴定增强SXR介导的反式激活作用的EDCs　　1、双报告基因检测55种化学物质对SXR介导大鼠CYP3A2、人CYP3A4及大鼠CYP7A1基因的反式激活活性的调节作用。　　2、双报告基因检测不同浓度的14种阳性EDCs对SXR介导大鼠CYP3A2反式激活活性的调节作用。　　3、双报告基因检测不同浓度的14种阳性EDCs对SXR介导人CYP3A4反式激活活性的调节作用。　　4、双报告基因检测不同浓度的14种阳性EDCs对SXR介导大鼠CYP7A1反式激活活性的调节作用。　　二、结合阳性EDC的SXR亚细胞定位　　共聚焦显微镜观察阳性EDCs处理的细胞中SXR的亚细胞定位。　　三、EDCs对CYP3A4基因mRNA转录的影响　　RT-PCR检测14种阳性EDCs对细胞内源CYP3A4基因mRNA水平的影响。　　结果：　　一、鉴定增强SXR介导的反式激活作用的EDCs　　1、55种化学物质中有14种物质几乎同等程度增强SXR介导大鼠CYP3A2、人CYP3A4及大鼠CYP7A1基因的反式激活活性。　　2、14种阳性EDCs增强SXR介导大鼠CYP3A2、人CYP3A4或大鼠CYP7A1基因的反式激活活性以剂量依赖的方式进行。　　二、结合阳性EDC的SXR亚细胞定位　　相对于无EDC处理的细胞内SXR在细胞核内弥散分布，阳性EDC处理的细胞核内SXR呈点状分布。　　三、EDCs对CYP3A4基因mRNA转录的影响　　14种阳性EDCs增强细胞内源CYP3A4基因的mRNA水平。　　结论：　　1.鉴定了14种增强SXR介导的人CYP3A4或大鼠CYP3A2基因反式激活活性的EDCs。　　2.14种阳性EDCs还通过SXR激活参与胆固醇代谢的大鼠CYP7A1基因的转录活性。　　3.阳性EDC活化的SXR在细胞核内呈点状分布。　　此研究为EDCs与通过SXR的类固醇或异生物代谢稳态间的关系提供证据。