中枢边缘系统由前额叶、下丘脑、海马、杏仁核等脑区组成,在调节机体应激和学习记忆等重要生理功能中发挥重要作用。促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）作为中枢神经系统中的神经多肽类调质,在应激反应和抑郁症等精神疾病发病过程中具有重要功能。以往的形态学研究表明CRH免疫阳性神经元广泛分布于皮层、下丘脑、海马、杏仁核等脑区,在皮层中CRH神经元作为中间神经元的一种参与局部环路的构成。但CRH神经元在前额叶皮层的分布特征和形成的神经环路及可能参与的应激调节机制未见报道。另外,在下丘脑室旁核（PVN）,传统的CRH神经元的输入、输出环路研究是基于化学示踪剂结合免疫组织化学和免疫电镜等方法。未能实现特定类型神经环路的特定标记。本研究目的在于:采用最新病毒示踪技术和高分辨率成像技术,在单细胞分辨率水平解析前额叶CRH局部及下丘脑全脑尺度输入投射神经环路。发现如下:在前额叶皮层CRH神经元环路的解析中,我们首先采用免疫荧光化学方法显示大小鼠前额叶皮层CRH阳性神经元的分布特征,观察到其胞体主要分布于皮层表层（Ⅰ-Ⅲ）,部分神经元树突具有垂直向上到达皮层表面及向下延伸至第4层的特征。初步观察发现向上的树突可能与脑膜结构或脑脊液有相互联系。经鉴定CRH阳性神经元与多种神经递质及调质共存如GABA、VIP、ChAT等阳性神经元。我们进一步采用CRH转基因荧光小鼠结合透明脑技术构建和描绘出CRH神经元自身在前额叶皮层形成的神经网络,发现相邻的CRH神经元之间可以形成树突-胞体、树突-树突联系。另外注射表达不同荧光蛋白的病毒并标记锥体神经元后,我们发现绿色标记的CRH神经元轴突可与第5层红色标记的锥体神经元胞体和树突形成相邻结构关系,提示他们之间可能构成突触联系。关于CRH神经元在前额叶参与的功能研究,行为学结合免疫组化实验表明束缚应激可导致CRH免疫阳性神经元的数目及树突膨大结构增加。另外一个实验组也正在进行CRH神经元在前额叶皮层相关电活动研究。至此,我们的研究详细解析了前额叶皮层CRH神经元构成的自身联系和与锥体神经元形成的局部环路及提示了其在应激反应中可能参与的功能。随后的研究中,我们详细解析了下丘脑室旁核CRH神经元的特异性全脑输入环路。采用CRH-Cre转基因小鼠注射Cre重组酶依赖的表达绿色荧光蛋白的AAV helpers和跨单突触传递的表达红色荧光蛋白的RV病毒,我们观察了小鼠全脑范围内CRH神经元接受的单突触输入投射。发现除嗅球外的前脑、中脑、后脑等脑区均有荧光标记的投射神经元分布,基底前脑、视前区、下丘脑、脑干网状核等核团具有大量的投射神经元标记。尤其重要的是,我们首次观察到前额叶皮层对下丘脑CRH神经元的直接投射,其投射神经元分布于眶皮层、运动皮层、内侧前额叶皮层等亚区,主要位于这些皮层的Ⅴ、Ⅵ层。因病毒标记具有较好的神经元形态,可以观察到前额叶标记的神经元大多具有明显的锥体神经元特征,如伸向皮层表面的顶树突及分支、基树突、向下延伸的轴突等结构,另外树突棘结构清晰可见。由于实验存在病毒注射位点扩散范围及感染效率的差异性,我们比较了起始病毒感染局限于PVN内部和扩散至下丘脑外部其他区域的样本间的全脑输入投射差别,发现由于注射位点病毒感染效率差异及不同扩散范围不同,导致全脑输入投射神经元分布脑区及密度的差异。我们进一步统计比较了全脑范围各个脑区投射神经元的数目。与华中科技大学合作,采用荧光显微切片光学断层成像（fMOST）方法,我们获得了全脑范围的单细胞分辨水平的下丘脑CRH神经元输入投射图谱。经过数据处理得到了全脑输入投射神经元三维立体分布图及精细展现前额叶、终纹床核、杏仁核、室旁核内部等投射神经元的形态及形成的局部环路连接。我们还分割描绘了前额叶标记的锥体神经元的整个形态及追踪到了其轴突延伸至下丘脑注射位点附近区域。以上的追踪标记和图像解析技术,首次在全脑尺度展现了下丘脑室旁核CRH神经元特异性单突触输入投射。通过以上研究,我们详细解析了前额叶皮层CRH中间神经元形成的局部环路及下丘脑室旁核CRH神经元的直接输入投射。研究结果提示,前额叶皮层CRH作为局部环路中的神经调质参与前额叶皮层对应激反应的调节。前额叶皮层椎体神经元对下丘脑室旁核CRH神经元的兴奋性递质单突触的直接支配,提示皮层随意系统对下丘脑不随意自主功能可能存在有一条新的调节通路。