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胎盘是连接母体和胎儿结构的嵌合器官,对于妊娠维持和建立至关重要。胎盘滋养细胞分化为锚定绒毛滋养细胞和绒毛外滋养细胞,延伸穿过合体滋养细胞层,并通过蜕膜间质和血管内途径侵入母体子宫组织、重塑螺旋动脉,建立子宫胎盘循环以及随后的氧气和营养物质运输过程[1]。然而,EVT侵入子宫蜕膜的不足以及随后螺旋动脉重塑异常会导致自然流产、先兆子痫等不良妊娠结局[2,3]。目前,滋养细胞分化调节的具体分子机制仍不清楚。本研究采用人早孕绒毛组织、小鼠胎盘组织和人滋养细胞系结合相关组织形态学分析技术、分子生物学和细胞生物学检测技术,探究滋养细胞分化过程和自然流产发病机制,研究结果如下:一、生理性低氧经HIF1α的下游靶基因参与EVT分化调控首先对转录因子HIF1α靶基因和EVT分化过程中的差异表达基因进行生物信息学分析,并筛选出二者交集基因,作为转录因子HIF1α调控EVT分化的潜在靶标基因。同时采用滋养细胞生理性低氧模型、RT-q PCR和Western blot等方法进行实验验证,发现生理性低氧（8%O2）处理后,转录因子HIF1α及其下游靶基因WIPF1、PLOD2、HPCAL1、SLC16A3、FAM174B和SYDE1均上调表达,而NREP和CD4下调表达。过表达HIF1α后,上述基因被调控并呈现与生理性低氧处理后相同的表达模式。利用滋养细胞诱导分化模型针对上述关键因子的表达进行实验验证,发现在滋养细胞侵袭表型分化过程中WIPF1、PLOD2上调表达。提示在生理性低氧通过HIF1α调控滋养细胞下游靶基因参与EVT侵袭分化过程。二、PLOD2和WIPF1促进滋养细胞的迁移和侵袭鉴于滋养细胞在成功侵袭过程需要形成肌动蛋白细胞骨架突出结构伪足小体,同时降解细胞外基质相辅相成[4]。我们进一步从细胞外基质重构相关基因PLOD2及肌动蛋白细胞骨架重塑相关基因WIPF1开展后续研究。第一,基于PLOD2基因,通过Transwell侵袭、细胞划痕和绒毛外植体实验,发现敲低靶基因PLOD2后可显著抑制滋养细胞的侵袭、迁移和外植体外延水平。为了探究PLOD2对滋养细胞EMT的影响,我们检测了滋养细胞EMT标志物表达水平,发现干扰PLOD2抑制了滋养细胞上皮–间质转换。第二,针对WIPF1基因,通过上述实验同样发现干扰WIPF1后可对滋养细胞侵袭、迁移和外植体外延能力产生抑制,然而,过表达WIPF1后产生相反效果。为了进一步探究WIPF1参与滋养细胞侵袭分化的分子机制,我们采用过表达WIPF1质粒转染HTR-8/SVneo细胞,通过IP-MS发现WIPF1互作蛋白。利用GO及KEGG分析,结果显示WIPF1互作蛋白主要与肌动蛋白细胞骨架关键基因ACTN4及EMT相关基因Vimentin有关。通过细胞骨架染色发现,敲低WIPF1干扰滋养细胞的细胞骨架重塑和非典型伪足小体的形成,而过表达WIPF1产生相反效果。提示在PLOD2和WIPF1参与EVT迁移、侵袭和EMT过程,是调控EVT功能的重要因子。三、WIPF1经YAP促进滋养细胞侵袭利用滋养细胞系HTR-8/SVneo和JEG-3的WIPF1干扰和过表达模型和Western blot方法检测了相关EMT蛋白表达,结果显示WIPF1过表达可促进滋养细胞上皮间质转换（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）。进一步通过EMT激活剂TGFβ1对HTR-8/SVneo细胞进行诱导,Western blot检测蛋白水平发现WIPF1、N-Cadherin均可被TGFβ1诱导,并且挽救由于敲低WIPF1导致的WIPF1水平下调及其引起的N-Cadherin的下调,促进滋养细胞EMT。此外,通过免疫荧光法和Western blot法检测了YAP和β-catenin的滋养细胞定位和蛋白表达水平,结果显示过表达WIPF1较对照细胞YAP和β-catenin核表达和蛋白水平上调,反之,敲低WIPF1较对照细胞YAP核表达和蛋白水平下调。不仅如此,通过YAP抑制剂VP处理滋养细胞,结果发现YAP抑制剂下调对照组YAP、Vimentin,同时上调E-Cadherin,并且WIPF1过表达组可以上调YAP抑制剂组上皮标记蛋白E-Cadherin,促进滋养细胞EMT。有趣的是,HTR-8/SVneo细胞敲低和过表达WIPF1,并使用TGFβ1处理后,发现TGFβ1诱导的阴性对照质粒组细胞、敲低WIPF1组细胞的YAP核表达水平上调。不仅如此,在HTR-8/SVneo细胞经过VP处理后可显著降低转染阴性对照质粒NC-m Cherry组和过表达WIPF1组细胞的的肌动蛋白骨架重塑及非典型伪足小体荧光强度和数目。提示WIPF1作为上游因子介导YAP参与EVT肌动蛋白骨架重塑和EMT调控过程,促进滋养细胞侵袭。四、WIPF1异常表达参与自然流产发生采用免疫组化和免疫荧光法,发现WIPF1在早孕绒毛中高量表达,但在流产绒毛中低表达,同样在正常小鼠妊娠第八天母胎界面由PL1标记的滋养巨细胞（Trophoblast giant cell,TGC）位置高表达,但在流产小鼠TGC低表达。这暗示WIPF1的异常表达可能参与自然流产发生。本研究证实生理性低氧可以诱导HIF1α上调,并进一步介导其下游靶基因PLOD2、WIPF1的上调表达,促进EVT分化,其异常表达可能参与自然流产的发生,为揭示自然流产发病的潜在靶标因子及其分子机制提供了科学依据。