第一部分:重组人粒细胞集落刺激因子对脑缺血再灌注大鼠的神经保护作用　　目的:利用局灶性脑缺血再灌注模型，观察rhG-CSF对脑缺血后的神经保护作用。　　方法:健康雄性SD大鼠，质量280～320g。随机分为3组:假手术组(sham组)，生理盐水对照组(Nacl组)，rhG-CSF治疗组。每组又随机分为缺血24h、7d和14d时间点组，每一时间点均为6只大鼠。线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)模型:按Zea-Longa5分制标准评分，其中0分和4分者被剔除。动物模型缺血90min时再灌注，于再灌注开始，治疗组予rhG-CSF50μg/(kg·d)，腹部皮下注射，连续5天。生理盐水对照组予等量生理盐水。每只大鼠均于缺血再灌注24h、7d、14d时分别进行神经功能缺损评分，评分标准应用改良神经功能缺损评分表。各组大鼠分别记录死亡数。　　结果:　　1、死亡率统计:为保证Nacl组和rhG-CSF治疗组每个时间点实验成功动物数均为6只大鼠。Nacl组共进行39只大鼠的模型制作，总死亡率为53.85％(21/39)。给予50μg/(kg·d)的rhG-CSF治疗组死亡动物较少，共进行24只动物的模型制作，死亡率为25％(18/24)。两者之间的差别具有统计学意义(P＜0.05)。　　2、神经功能评分统计:缺血再灌注24h时，Nacl组和治疗组较假手术组神经功能评分上升，表明认为神经功能下降，差异有显著性(P＜0.05)。但Nacl组和治疗组神经功能评分无明显差异(P=0.131)。缺血再灌注7d时，Nacl组和治疗组较假手术组神经功能评分差异有显著性(P＜0.05)，治疗组较Nacl组神经功能评分差异有显著性(P＜0.05)。即认为治疗组和Nacl组神经功能均较假手术组差，但治疗组神经功能较Nacl组神经功能恢复较好。缺血再灌注14d时，各组两两比较差异均有显著性(P＜0.05)。即治疗组神经功能较Nacl组神经功能恢复较好。　　小结:rhG-CSF能降低脑缺血大鼠死亡率;rhG-CSF能改善脑缺血大鼠神经功能，说明rhG-CSF具有神经保护作用。　　第二部分粒细胞集落刺激因子对脑缺血再灌注大鼠自噬作用的影响　　目的:观察rhG-CSF治疗对脑缺血再灌注大鼠自噬的影响。　　方法:健康雄性SD大鼠，质量280～320g。随机分为3组:假手术组(sham组)，生理盐水对照(Nacl组)，rhG-CSF治疗组。每组均为6只大鼠。线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)模型:按Zea-Longa5分制标准评分，其中0分和4分者被剔除。动物模型缺血90min时再灌注，于再灌注开始，治疗组予rhG-CSF50μg/(kg·d)，腹部皮下注射，连续5天。生理盐水对照组予等量生理盐水。治疗结束后取材。采用免疫组化法检测LC3的表达，采用Westernblot检测、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、LAMP-2a、HSC-70的表达。　　结果:　　1、免疫组化结果:与假手术组相比，对照组及实验组大鼠的自噬蛋白LC3阳性表达高于假手术组，rhG-CSF治疗组的自噬蛋白LC3阳性表达要高于假手术组和生理盐水对照组，差异有统计学意义;　　2、Westernblot结果:取脑缺血灶周边区域脑组织;与假手术组相比，对照组及实验组大鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、HSC-70及LAMP-2a表达明显上调(P＜0.05);与对照组相比，实验组大鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、HSC-70及LAMP-2a表达明显上调(P＜0.05)。　　小结:rhG-CSF可以在动物水平上调脑缺血灶周边区域细胞自噬的作用。　　第三部分粒细胞集落刺激因子对脑缺血氧糖剥夺模型自噬的影响　　目的:利用SH-SY5Y细胞制备氧糖剥夺模型，观察rhG-CSF治疗后自噬指标的变化。　　方法:取对数生长期SH-SY5Y细胞，随机分为3组:对照组、低剂量rhG-CSF组、高剂量rhG-CSF组。用氧糖剥夺(OGD)法制作细胞缺氧模型，更换培养液为无血清，无糖人工脑脊液(nACSF)，培养30分钟后移入至4000cm3恒温(37℃)HERACELL150三气培养箱，连续充以无氧气体(90％N2，9％CO2和1％O2)，继续培养4小时取出，更换原培养液，分别给予0μg/L，100μg/L和200μg/LrhG-CSF处理，继续原环境培养完48h。　　采用MTT比色法检测细胞活性，以MDC荧光染色法检测自噬空泡变化。Westernblot方法检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、LAMP-2a、HSC-70的表达。　　结果:　　1、细胞活性的变化:与0μg/LrhG-CSF对照组相比，100μg/L、200μg/LrhG-CSF对缺氧后SH-SY5Y细胞的增殖活性明显增加(P＜0.05);与100μg/LrhG-CSF组相比，200μg/LrhG-CSF对缺氧后SH-SY5Y细胞的增殖活性明显增加(P＜0.05)。显示随rhG-CSF药物浓度的升高，细胞活力增加明显。　　2、自噬空泡数的变化:通过与对照组相比、rhG-CSF处理组的SH-SY5Y细胞进行MDC染色，rhG-CSF处理组细胞胞质中出现大量的大小不一的点状结构，随着rhG-CSF浓度的增加，MDC染色阳性信号明显增强，而未处理组的对照细胞胞质中仅见零星的荧光阳性的小点状结构，发光很弱，只可看见模糊细胞轮廓。统计数据显示:与0μg/LrhG-CSF对照组相比，100μg/L、200μg/LrhG-CSF组自噬泡明显增加(P＜0.05);与100μg/LrhG-CSF组相比，200g/LrhG-CSF自噬泡明显增加(P＜0.05);显示随rhG-CSF药物浓度的升高，细胞自噬增加明显。　　3、Westernblot结果:rhG-CSF干预48小时后，100μg/L组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、LAMP-2a及HSC-70水平要高于0μg/L组(P＜0.05);200μg/L组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、LAMP-2a及HSC-70比值水平要高于100μg/L组(P＜0.05)。　　小结:1、rhG-CSF具有促进神经元细胞增殖活力的作用;2、rhG-CSF可以在细胞水平上调缺血细胞自噬的作用。3、rhG-CSF在细胞水平上调控自噬水平具有随剂量浓度增加作用增强的趋势;　　结论:　　1、rhG-CSF能提高脑缺血大鼠的神经功能，具有神经保护作用;　　2、rhG-CSF能能增加细胞缺血后自噬空泡数，上调自噬细胞活性，上调自噬标志物的表达，且其上调自噬的能力随剂量的增大而增强。　　3、rhG-CSF的神经保护作用可能是通过调节自噬实现的，且其调节自噬的能力在一定范围内可能呈剂量依赖性。