论文部分内容阅读
目的:研究还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Reduced Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate,NADPH)在海人藻酸(Kainic acid,KA)介导的兴奋性毒性中的作用及其分子调控机制。方法:采用立体定位注射单侧纹状体给予KA,建立KA受体介导的神经兴奋性毒性大鼠体内模型;通过尾静脉注射NADPH,再立体定位注射KA,建立NADPH处理组。采用KA处理体外培养的大鼠原代皮层神经元,建立神经兴奋性毒性体外模型;KA处理细胞之前,用NADPH预处理,建立NADPH处理组。体内实验中,通过尼氏染色法检测大鼠KA模型组和NADPH处理组纹状体的损伤面积,观察KA对大鼠纹状体的损伤作用以及NADPH对KA介导的兴奋性毒性损伤的保护作用;通过Western blot检测KA模型组和NADPH处理组的TP53介导的糖酵解和凋亡调节因子(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR)和自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62、Beclin1蛋白水平的变化。体外实验中,通过CCK-8法检测KA模型组和NADPH处理组原代神经元的存活率,观察KA对原代神经元的损伤作用以及NADPH对KA介导的兴奋性毒性损伤的保护作用;通过钙离子荧光探针Fluo-3 AM标记,检测模型组和NADPH处理组的原代神经元细胞内钙离子浓度的变化;通过超氧化物阴离子荧光探针(Dihydroethidium,DHE)标记,检测KA模型组和NADPH处理组的原代神经元活性氧水平的变化;通过GSH/GSSG试剂盒,检测KA模型组和NADPH处理组的原代神经元内还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)水平的变化;通过Western Blot检测KA模型组和NADPH处理组的TIGAR和自噬/溶酶体通路相关蛋白水平的变化,包括自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62、Beclin1、ATG5以及溶酶体组织蛋白酶 active-cathepsin B 和 active-cathepsin D。结果:本实验成功建立了大鼠神经兴奋性毒性的体内和体外模型。体内模型中,尼氏染色结果显示,KA模型组与正常对照组相比,纹状体损伤面积明显增大,NADPH可减缓KA介导的纹状体损伤。Western Blot结果显示,与正常对照组相比,KA模型组TIGAR和p62蛋白表达水平降低、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1蛋白表达水平增加,NADPH抑制了 KA介导的TIGAR、p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1蛋白水平的变化。体外实验中,CCK-8结果显示,KA介导的兴奋性毒性引起神经元损伤,并且具有一定的时间依赖性和剂量依赖性,NADPH能显著增加神经元的存活率。Fluo-3 AM荧光探针标记结果显示,KA引起细胞内钙离子浓度显著升高,给予NADPH能有效降低钙离子浓度。DHE结果显示,KA引起细胞内ROS水平显著增加,给予NADPH能有效降低ROS水平。GSH/GSSG检测的结果显示,KA引起细胞内还原型GSH减少,NADPH能抑制KA介导的还原型GSH的减少。Western Blot结果显示,KA引起 TIGRA 和 p62 蛋白表达降低以及 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1、ATG5、active-cathepsin B和active-cathepsin D蛋白表达增加,NADPH可抑制KA引起的以上蛋白的表达变化。结论:在KA介导的神经兴奋性毒性模型中,NADPH通过抑制细胞内的氧化应激和自噬/溶酶体通路,从而发挥保护神经元的作用。