洋葱假单胞菌脂肪酶对各种有机溶剂(醇等)、热、氧化剂、表面活性剂、去污剂、蛋白酶等均有较好的抗性,是目前在有机合成、洗涤剂添加剂、生物柴油合成中应用得最为广泛的脂肪酶之一。本文以产脂肪酶的洋葱假单胞菌PCL-3为出发菌株,对其摇瓶、10L发酵罐产酶条件和工艺进行了优化,并就脂肪酶的分离纯化工艺进行了初步探索。主要工作如下:(1)采用单因子试验筛选出糊精为最适碳源,蛋白胨和尿素为最适复合氮源。通过Plackett-Burman设计,对影响产酶条件的8个相关因子进行评估并筛选出具有显著效应的三个因子:尿素、接种量和初始pH值。用最陡爬坡实验逼近显著因子的最大响应区域后,采用响应面分析法,确定尿素、接种量及初始pH值的最优组合值分别为0.15%,3.05%和8.59。优化后脂肪酶活力提高到48.88 U/ml(pNPP法),比初始酶活25.37U/ml提高了1.93倍。在优化条件的基础上,考察不同的表面活性剂、诱导物和消泡剂对发酵的影响。结果表明:培养基中适当加入一定量的表面活性剂能显著提高脂肪酶的产量;桐油、菜籽油、茶油和豆油可以替代价格较高的橄榄油作为脂肪酶诱导剂,进一步降低脂肪酶生产成本;加入低于0.05%的有机硅类消泡剂有利于脂肪酶的生产。(2)摇瓶发酵、分批发酵、分批补料发酵时脂肪酶的最高酶活力分别达到19.5U/ml、18 U/ml、22.75 U/ml,最大细胞干重分别为为11.96g/l、7.39 g/l、10.019 g/l。分批发酵时最高的酶活比摇瓶低。与分批发酵过程相比,分批补料操作提高了细胞密度和酶活,酶活比摇瓶提高16.67%。分批发酵的最优条件是:温度28℃,转速为300rpm,通气量0.694vvm,初始pH为8.2,溶氧控制大于10%;以分批发酵最优参数为基础,分批补料操作的最优条件是:发酵开始7h以4.08ml/h的补料速率连续补加大豆油,至终浓度为1%时停止补料。(3)分别采用硫酸铵分级沉淀和乙醇分级沉淀从洋葱假单胞菌PCL-3发酵粗酶液中分离纯化脂肪酶。结果表明:硫酸铵浓度为20%~40%饱和度区间脂肪酶的纯化倍数达到1.87倍,沉淀透析后纯化倍数提高到2.65倍,回收率为72.8%;乙醇沉淀过程中调节发酵液上清的pH为5.0,加入终浓度为2mg/ml的海藻酸钠有利于脂肪酶的沉淀,分级沉淀结果表明加入的乙醇体积为发酵液上清的1倍时,比酶活最大,纯化倍数最高为1.81倍,回收率为76.7%。不同批次的发酵液冻干后粗酶粉的蛋白质比酶活均比冻干前有所提高,最高提高了1.32倍。SDS、Triton X-100、和Tween 80三种表面活性剂对脂肪酶都具有一定的激活作用,其中Triton X-100效果最好,作用2h后酶活提高约1.7倍。粗酶液中Ca2+浓度在1-3mM时能提高脂肪酶的稳定性。