第一部分TFEB在糖尿病大鼠肾组织及高糖培养足细胞中的表达及意义目的:糖尿病是全球范围的一种慢性疾病,在现代生活方式和环境之下发病率高,且逐年上升。统计数据显示,到2030年世界糖尿病人口预计将增加到近4亿人。糖尿病的慢性并发症影响不同的器官和组织,包括肾脏、心脏、眼睛、血管和周围神经等。糖尿病是慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）最常见的继发原因,影响到全球7.2%的成年人。患2型糖尿病的成人中CKD的患病率可达40%。多数可以进展至终末期肾病（end stage renal disease,ESRD）。同时糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）患者心血管疾病的发病风险明显高于普通人群,CKD和糖尿病被认为是心血管疾病的重要危险因素,三者互相影响,是多种疾病发生发展的关键因素。目前关于糖尿病肾病发病机制的研究涉及了肾素血管紧张素系统的激活、线粒体损伤和活性氧（reactive oxygen species,ROS）的过度生成、晚期糖基化终产物（advanced glycation end-products,AGEs）的形成、内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）和促炎细胞因子释放等。氧化应激被认为是糖尿病及其并发症发生发展共同的始动环节,ROS在其中发挥了关键的作用。ROS同时也是体内重要的信号分子,在维持正常生理功能中不可缺少。ROS的过度产生与体内抗氧化防御系统的失衡导致了肾脏细胞的凋亡、纤维化、衰老、死亡等事件,进而影响肾脏功能,最终肾小球硬化。糖尿病的高糖环境可以诱导ROS累积,激活多条信号通路,使各种分子发生氧化修饰和损伤,而线粒体损伤会进一步加重氧化还原失衡,形成不良的反馈系统。因此,在其发生机制中寻找干预靶点,打破循环,恢复细胞内稳态是防治糖尿病肾病的途径之一。转录因子EB（transcription factor EB,TFEB）是亮氨酸拉链类（basic-helix-loop-helix leucine zipper,bHLH-LZ）转录因子家族中的成员,以磷酸化状态稳定于细胞浆,受到不良刺激后脱磷酸化转位进入细胞核启动下游基因转录,发挥不同的生物学功能。TFEB参与了多种病理生理过程,如:调节线粒体功能、增强自噬、改善脂质及能量代谢、抑制炎症因子释放等。有研究发现,在给予高糖高脂饮食的小鼠和晚期糖基化终产物培养的肾小球系膜细胞中TFEB表达下调,另有报道过表达TFEB的单层足细胞,能够恢复白蛋白的选择通透性。TFEB可能在糖尿病导致的肾脏损害中发挥了功能。但它的作用机制是什么,是否是联结线粒体应激和糖尿病肾病的一个节点目前尚无相关研究文献。本部分旨在通过研究TFEB在糖尿病大鼠肾脏组织和高糖培养小鼠足细胞中的表达变化及分布,初步明确TFEB与氧化应激和凋亡的关系。方法:1动物模型的建立和标本收集:健康雄性SD大鼠随机分为两组,一组为正常对照组（normal control group,NC）,另一组为糖尿病模型组（diabetic group,DM）,每组18只。DM组大鼠按65 mg/kg体重给予腹腔单次注射1%STZ溶液,NC组大鼠给予相当体积的0.1 mol/L无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。注射后72小时,取尾静脉血检测血糖。若血糖≥16.7mmol/L且尿糖阳性（+++⁺+++）认为糖尿病模型造模成功。两组动物分别于造模成功后8周、12周末随机取6只采集标本。处死前10%水合氯醛腹腔注射麻醉,股动脉取血用于检测血糖、血尿素氮和血肌酐值。打开腹腔取双侧肾脏,切取部分肾组织固定于4%多聚甲醛溶液中,用于后续HE染色、PAS染色及免疫组织化学检测。切取剩余部分肾皮质经液氮处理后冻存于-80℃冰箱,用于制备组织匀浆提取肾组织蛋白及RNA。免疫组织化学、western blot和qRT-PCR检测肾皮质TFEB、SOD2、Cleaved-caspase3的蛋白和mRNA的表达水平。2小鼠足细胞培养、分组和标本收集:永生化小鼠足细胞培养于33℃、5%CO₂培养箱,培养基为含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素、10U/mlγ-IFN的DMEM/F12（5:1）培养基,使其增殖。移入37℃、5%CO₂培养箱,应用去除γ-IFN的上述培养基培养,使足细胞逐渐分化成熟。2天换液一次,细胞生长至80%-90%进行传代。将分化成熟的足细胞分为正常浓度糖培养组（NG,葡萄糖5.5mmol/L）、甘露醇高渗对照组（M,葡萄糖5.5mmol/L、甘露醇24.5mmol/L）和高浓度糖培养组（HG,葡萄糖30mmol/L）分别培养,并于6小时、12小时、24小时、48小时和72小时收集细胞。提取总蛋白、细胞浆和细胞核蛋白以及RNA,通过western blot检测不同时间点整体细胞内、细胞核、细胞浆TFEB蛋白的表达量,总SOD2、Cleaved-caspase3的表达量。应用qRT-PCR检测TFEB mRNA的表达,细胞免疫荧光染色检测TFEB在足细胞中的分布。结果:1.生化指标检测结果显示,糖尿病大鼠血糖、血肌酐和尿素氮水平较正常对照组大鼠明显增高（P<0.01）;2.HE和PAS染色结果可见,正常对照组肾小球和肾小管间质结构正常,12周糖尿病大鼠肾小球体积增大,系膜区增宽,细胞增多,部分肾小球硬化,部分肾小管代偿性扩张,上皮细胞空泡样变性;3.Western blot结果显示,与正常对照组相比,8周糖尿病大鼠肾皮质TFEB表达明显降低,到12周降低至对照组的58.5%（P<0.01）;qRT-PCR结果也显示了相同的趋势（P<0.01）;免疫组织化学可见TFEB主要表达于肾小球,表达量随着糖尿病病程的延长明显减低（P<0.001）;4.与正常对照组相比,糖尿病大鼠肾组织Cleaved-caspase3表达显著升高,SOD2表达明显降低,且与TFEB的降低呈正相关（P<0.001）;5.足细胞中,随着高糖刺激时间的延长,TFEB蛋白和mRNA呈现先升高后降低的趋势,48小时和72小时显著降低（P<0.01）;HG刺激24小时内TFEB发生核转位,核蛋白中TFEB含量明显高于NG组（P<0.01）,而浆蛋白中变化不明显。细胞免疫荧光染色显示NG组荧光积聚于细胞浆,而HG组细胞核区域荧光明显增强;6.与NG组相比,HG组SOD2表达在24小时明显降低,并随着时间的延长更加显著,Cleaved-caspase3则随着高糖刺激时间的延长而升高,同时SOD2与TFEB的相关性检测显示二者呈正相关（P<0.01）。第二部分TFEB对高糖诱导的小鼠足细胞氧化应激和凋亡的影响及机制目的:在糖尿病肾病发生的早期主要是肾小球受累,甚至在蛋白尿之前就发生足细胞损伤。足细胞作为肾小球滤过屏障的组分之一,在各种肾脏疾病中起到了重要作用。肾脏是线粒体含量丰富的器官,线粒体既是氧化磷酸化产生ATP的细胞器也是最容易受到过度产生的ROS损害细胞器。线粒体作为能量供应的细胞器,是多种促凋亡因素的作用靶点,阻断有氧呼吸,达到凋亡目的。线粒体在机体内处于动态平衡,不断的合成与清除,分裂与融合,保持更新和稳态。高糖也是打破这些平衡的因素之一,进而引起线粒体应激,ROS蓄积,激活促凋亡通路。已发表文献可以看到TFEB参与了线粒体质量控制,增加线粒体选择性自噬,在骨骼肌和心肌细胞TFEB能够改善呼吸链复合物的活性,增加ATP合成。敲低TFEB会导致成骨细胞线粒体内ROS过度产生,而过表达TFEB则可在一定程度上清除过多的ROS。TFEB在凋亡方面起到负调节作用,敲低TFEB表达可以引起成骨细胞和骨骼肌细胞凋亡的增加。前一部分研究,我们发现TFEB在糖尿病肾病和高糖环境中表达下调,与抗氧化酶SOD2表达降低正相关,同时凋亡相关因子Cleaved-caspase3表达升高。推测TFEB可能参与了糖尿病肾病的发病过程,但机制不明,是否与改善线粒体功能,抑制凋亡相关需要进一步研究。方法:1筛选最优转染条件,将Lipofectamin3000转染试剂和TFEB过表达质粒按不同比例和量混合转染足细胞,应用western blot和qRT-PCR检测TFEB的表达,选择转染的最佳条件。2检测TFEB对于高糖环境下小鼠足细胞氧化应激的影响,分组为:正常浓度糖培养组（NG,葡萄糖5.5mmol/L）、高浓度糖培养组（HG,葡萄糖30mmol/L）、高糖+空载体组（HG+Control）、高糖+TFEB质粒转染组（HG+TFEB）及NAC阳性对照组（HG+NAC 5mmol/L）。刺激48小时后收集细胞,应用western blot和qRT-PCR检测SOD2、HO1的表达,通过mito sox red荧光探针应用激光共聚焦显微镜检测线粒体内ROS含量,通过DCFH-DA荧光探针应用流式细胞术检测细胞内ROS含量。3检测TFEB对于线粒体相关蛋白表达和线粒体形态、功能的影响,足细胞分为正常浓度糖培养组（NG,葡萄糖5.5mmol/L）、高浓度糖培养组（HG,葡萄糖30mmol/L）、高糖+空载体组（HG+Control）、高糖+TFEB质粒转染组（HG+TFEB）。western blot和q RT-PCR检测COX IV、PGC-1α和TFAM的表达;应用激光共聚焦显微镜,通过mito tracker red观察线粒体形态,通过JC-1探针检测线粒体膜电位变化,通过透射电子显微镜观察线粒体超微结构。4检测高糖环境对足细胞凋亡和Akt/Bad信号通路活性的影响,足细胞分为正常浓度糖培养组（NG,葡萄糖5.5mmol/L）、高浓度糖培养组（HG,葡萄糖30mmol/L）,分别于高糖刺激6小时、12小时、24小时、48小时、72小时收集细胞,提取蛋白,western blot检测Nephrin、Cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2、P-Akt、Akt、P-Bad、Bad和Bcl-xl的表达。5检测TFEB对高糖诱导足细胞凋亡和Akt/Bad信号通路活性的影响,足细胞分为正常浓度糖培养组（NG,葡萄糖5.5mmol/L）、高浓度糖培养组（HG,葡萄糖30mmol/L）、高浓度糖+空载体组（HG+Control）、高浓度糖+TFEB质粒转染组（HG+TFEB）及LY294002对照组（HG+TFEB+LY294002 20umol/L）,各组均在高糖刺激48小时后收集标本准备提取蛋白,检测Nephrin、Cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2、P-Akt、Akt、P-Bad、Bad、Bcl-xl和CytochromeC的表达。通过流式细胞术检测各组凋亡率的变化。结果:1.Lipofectamin 3000 3.75ul+pcDNA3.1（+）-Tfeb 2.5ug+P3000 5ul组转染足细胞获得最好的TFEB表达效果。2.过表达TFEB可以增加抗氧化应激蛋白的表达,减轻高糖诱导的氧化应激。Western blot结果,与NG组相比,HG组SOD2和HO1的表达显著降低（P<0.01）,过表达TFEB组可以使二者表达增加,与阳性对照HG+NAC组无差异;qRT-PCR检测mRNA水平变化趋势与此一致（P<0.001）。共聚焦显微镜下可见,HG组较NG组红色荧光明显增强,线粒体内ROS增多,HG+TFEB荧光强度较HG+Control组减弱;流式细胞分析结果显示HG组较NG组荧光强度增加了48.2%（P<0.01）,细胞内ROS累积增多,过表达TFEB组较HG+Control组荧光强度减弱（P<0.01）。3.过表达TFEB增强了线粒体生物合成,改善了高糖损伤线粒体的结构和功能。Western blot结果显示,HG刺激降低了足细胞线粒体相关蛋白COX IV、PGC-1α和TFAM的表达（P<0.05）,而过表达TFEB组较HG+Control组表达有所回升（P<0.05）;qRT-PCR检测mRNA变化与蛋白一致（P<0.01）。通过共聚焦显微镜和透射电镜下超微结构可以看到NG组线粒体呈丝状、短棒状,结构完整,嵴规则清晰,而HG组线粒体结构破碎、肿胀、嵴消失,HG+TFEB组较HG+Control组碎片化减少,正常形态线粒体增多;通过JC-1荧光探针,可以观察到NG组JC-1红色荧光明显强于绿色荧光,而HG组较NG组JC-1绿色荧光明显增强,提示线粒体膜电位显著降低,过表达TFEB组较转染空载体组红色荧光有所增强,可部分恢复高糖降低的膜电位。4.高糖诱导了小鼠足细胞凋亡相关蛋白的表达,抑制Akt/Bad信号通路活性,呈时间依赖性。Western blot结果显示,随着HG刺激时间的延长,Nephrin表达逐渐降低,Cleaved-caspase3及Bax/Bcl-2表达逐渐增高（P<0.01）。P-Akt先升高后降低,HG刺激12小时升高了70%（P<0.01）,之后逐渐下降,至72小时P-Akt/Akt和P-Bad/Bad分别降至NG组的48%和45%（P<0.05）。5.过表达TFEB激活了Akt/Bad信号通路的磷酸化。Western blot结果显示,与HG+Control组相比较,TFEB组P-Akt/Akt、P-Bad/Bad的比率以及Bcl-xl表达显著增加（P<0.01）,但是这一效果被Akt磷酸化抑制剂LY294002所抑制（P<0.01）。同时过表达TFEB降低了凋亡相关蛋白的表达,与HG+Control组相比较,TFEB过表达增加了Nephrin的表达,降低了Bax/Bcl-2及Cleaved-caspase3的表达（P<0.05）,LY294002使TFEB的改善作用减弱（P<0.05）;HG组线粒体细胞色素C明显减低（P<0.001）,而胞浆含量明显增加（P<0.01）,HG+TFEB较HG+Control组线粒体细胞色素C升高（P<0.001）,胞浆含量明显有所降低（P<0.01）。流式细胞仪分析发现,HG组凋亡率是NG组的4倍（P<0.001）,过表达TFEB可使HG诱导的凋亡率降低39%（P<0.01）,HG+TFEB+LY294002组凋亡率明显高于TFEB过表达组（P<0.001）。第三部分非瑟酮对高糖诱导的小鼠足细胞氧化应激与凋亡的保护作用目的:非瑟酮（3,7,3’,4’-四羟基黄酮）是一种黄酮类化合物,广泛存在于多种日常水果、蔬菜、坚果和葡萄酒中,具有多种药理学作用。它具有很低的氧化电位,有较强的还原能力,是一种有效的抗氧化剂和自由基清除剂,另外还可以抑制炎症因子、减轻凋亡、改善脂代谢、抑制癌细胞和新生血管及保护神经细胞等。在糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病等常见慢性病中发挥了积极的正向作用。非瑟酮目前在肾脏疾病中研究较少,有学者发现非瑟酮显著改善了顺铂引起的肾损伤,组织病理学改变,恢复了肾组织中抗氧化酶和线粒体呼吸酶活性,降低了凋亡相关蛋白的表达,调节NF-κB的激活和后续的肾脏组织炎症。在1型糖尿病动物模型中,非瑟酮具有减轻肾小球肥大及尿蛋白排泄的作用。目前有研究显示非瑟酮具有TFEB激动剂的作用,可以促进TFEB的表达及转位入核,发挥细胞保护作用。因此,本部分研究将就非瑟酮对高糖刺激小鼠足细胞在氧化损伤和凋亡方面的作用进行探讨。方法:1为了确定非瑟酮安全有效的浓度,足细胞分为正常对照组（NC,葡萄糖5.5mmol/L）、非瑟酮5umol/L组、非瑟酮10umol/L组、非瑟酮20umol/L组、非瑟酮30umol/L组、非瑟酮40umol/L组。种植于96孔板用于MTT实验,检测各组细胞活性。种植于6孔板,各组在非瑟酮刺激24小时后收集标本提取蛋白和RNA。应用western blot和qRT-PCR检测TFEB蛋白和mRNA水平。种植于6孔板玻片上,应用细胞免疫荧光检测TFEB的分布。2为了明确非瑟酮对于高糖环境下足细胞氧化应激、凋亡和相关通路的影响,将足细胞分为正常浓度糖培养组（NG,葡萄糖5.5mmol/L）、高浓度糖培养组（HG,葡萄糖30mmol/L）、高浓度糖+DMSO对照组（HG+DMSO）、高浓度糖+非瑟酮组（HG+Fisetin 10umol/L）及TFEB-siRNA组（HG+Fisetin 10umol/L+siTFEB）,非瑟酮在高糖刺激前2小时加入,各组均在高糖刺激48小时后收集标本准备提取蛋白。结果:1.MTT实验结果显示非瑟酮5umol/L和10umol/L的浓度对细胞活性的影响与NC组无显著差异,20umol/L及更高浓度的非瑟酮则产生明显的抑制作（P<0.01）。2.非瑟酮促进了TFEB的表达和核转位。Western blot和qRT-PCR结果显示5umol/L的非瑟酮即可使TFEB的表达升高（P<0.05）,10umol/L与20umol/L表达量最高;分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白,发现非瑟酮刺激组细胞核TFEB含量较NC组明显增多（P<0.001）,而细胞浆中变化不明显;免疫荧光结果显示非瑟酮干预组细胞核区域荧光较NC组显著增强。3.非瑟酮减轻了高糖培养足细胞的氧化应激。Western blot结果显示HG降低了SOD2和HO1的表达,非瑟酮干预组使二者表达增加了45%和80%（P<0.05）,而HG+Fisetin+siTFEB组减弱了非瑟酮对于SOD2和HO1的升高作用;Mito sox red染色和流式细胞分析结果均显示代表ROS累积的荧光强度HG组明显强于NG组,而HG+Fisetin荧光强度较HG+DMSO组显著减弱,减少了ROS的累积;而转染siTFEB后非瑟酮的改善作用减弱。4.非瑟酮改善了高糖环境下足细胞线粒体的结构和功能。Western blot结果显示,HG刺激降低了足细胞线粒体相关蛋白COX IV、PGC-1α和TFAM的表达,而非瑟酮干预组较DMSO对照组三者表达明显回升,而si TFEB组PGC-1α和TFAM表达较HG+Fisetin组明显降低（P<0.05）。通过共聚焦显微镜检测JC-1荧光强度,HG组较NG组JC-1绿色荧光明显增强,线粒体膜电位显著降低,非瑟酮干预组红色荧光较DMSO对照组有所增强,非瑟酮可部分恢复高糖降低的膜电位,而siTFEB组膜电位明显低于非瑟酮干预组。5.非瑟酮减轻了高糖诱导的足细胞凋亡,上调Akt/Bad信号通路活性。Western blot结果,高糖诱导了足细胞的凋亡,非瑟酮干预可以提高Nephrin的表达水平同时使Cleaved-caspase3表达水平及Bax/Bcl-2比率较DMSO对照组明显降低（P<0.01）,而siTFEB组显著减弱了非瑟酮降低促凋亡蛋白表达的能力（P<0.01）。另外非瑟酮干预组明显增加了高糖所降低的Akt/Bad磷酸化水平,其下游分子Bcl-xl的表达也显著增加（P<0.05）,转染siTFEB组较非瑟酮干预组三者均有显著降低。流式细胞分析结果显示,HG组凋亡率是NG组的3.75倍（P<0.001）,而非瑟酮干预组凋亡率是DMSO对照组的60%（P<0.001）,转染siTFEB组凋亡率较非瑟酮干预组明显增高（P<0.05）。结论:1.TFEB在糖尿病大鼠肾组织和高糖环境下的小鼠足细胞中表达均显著降低。2.过表达TFEB可以明显减轻高糖诱导小鼠足细胞的氧化应激,增加抗氧化应激蛋白的表达,促进线粒体生物合成,维持线粒体稳态。3.过表达TFEB可以明显降低高糖刺激小鼠足细胞的凋亡,通过上调Akt/Bad信号通路活性,抑制了凋亡的线粒体调控途径。4.非瑟酮可以显著降低高糖导致的小鼠足细胞氧化应激反应,增加抗氧化应激蛋白的表达,改善线粒体的形态和功能。5.非瑟酮对于高糖培养的小鼠足细胞具有明显的抗凋亡作用,可能与Akt/Bad信号通路的激活,抑制了下游的线粒体凋亡通路有关。6.非瑟酮抗氧化应激、抗凋亡的作用是部分通过促进TFEB的表达和功能实现的。