麻疯树{Jatropha curcas L.)是大戟科能源作物,主要分布于全球热带和亚热带地区,种仁中脂肪类物质含量高,约21%的饱和脂肪酸和70%以上的不饱和脂肪酸,种子油流动性好,被认为是最有可能成为替代化石能源的植物油之一。为深入开展麻疯树基因组学研究,图位克隆功能基因、构建高密度物理图谱和基因组大规模测序,基因组大片段文库是必不可少的基础工具和平台。基因工程技术是改变植物油成分、培育新品种的有效方法之一,植物微粒体co-3脂肪酸去饱和酶基因(FAD3)是脂肪酸去饱和酶基因家族一员,主要催化细胞中亚油酸到亚麻酸的反应,研究表明在非光合作用的组织中,FAD3蛋白主要为ω-3去饱和酶的功能,催化组织中约80%三烯脂肪酸的合成。因此,对麻疯树微粒体ω-3脂肪酸去饱和酶基因的研究,不仅可以加深对植物种子油脂合成途径的理解,也为利用基因工程改善麻疯树种子油成分提供了理论依据。麻疯树BIBAC文库,用BamHⅠ限制性内切酶对基因组DNA进行部分酶切,两次酶切片段选择后,连接载体pCLD04541,转化E.coliDH1OB感受态细胞,蓝白斑筛选阳性克隆。该文库含有30,720个克隆,随机挑选214个克隆进行插入片段的评估,发现片段大小主要集中在141-160kb范围,平均插入片段大小为131.9kb,80%的克隆都具有100kb以上的插入片段,文库空载率为7.9%,所以该文库实际含有插入片段的BIBAC克隆数大约为28,293个。麻疯树基因组约为416Mbp,因此该文库约覆盖麻疯树二倍体基因组8.9倍,理论上筛选出任意基因的几率在99%以上。对随机挑取的5个BIBAC克隆进行稳定性检测表明,插入片段可以在宿主大肠杆菌中稳定保存。将麻疯树BIBAC文库中27,648个克隆(8.0×)以4×4点阵形式制备了高密度杂交膜。每张膜(22.5cm×11.25cm)上含有9,216个BIBAC克隆,每个克隆含有两个拷贝,高密度杂交膜包含整个文库90%以上的克隆,覆盖麻疯树二倍体基因组8.0倍。从NCBI上已经公布的与麻疯树脂肪酸代谢相关基因中选取9个基因(FAD3, FAD6, FAD7, ACCase, KAS Ⅰ, KASⅡ, KASⅢ acyl-ACP thioesterase和chloroplast acyl-ACP thioesterase),根据序列信息共设计15对探针同麻疯树高密度杂交膜杂交进行筛选,除acetyl-CoA carboxylase基因外,其他8个基因都检测到了阳性克隆,平均每个基因可以得到5.3个阳性克隆,该结果说明所构建的麻疯树BIBAC文库能够满足基因克隆研究的需要,并将是构建物理图谱及大规模基因组测序的有力工具。对选取的9个麻疯树脂肪酸代谢相关基因进行Southern分析,结果表明这9个基因在麻疯树基因组中均为单拷贝。将Southern结果中含有FAD3基因的克隆22G19和含有FAD7基因的克隆64D4分别测序并进行数据拼接,同NCBI数据库进行比对后结果表明,麻疯树叶绿体ω-3脂肪酸去饱和酶基因(FAD7)长度约为2655bp,含有8个外显子和7个内含子,氨基酸525个,转录起始位点位于上游-424～--374bp区域,起始碱基为位于-385bp的G,启动子区域为-1730-385bp。顺式作用元件分析表明FAD7基因含有较多的光响应元件,其次为对低温和高温的响应元件,干旱响应元件和胚乳特异表达的顺式作用元件。麻疯树微粒体ω-3脂肪酸去饱和酶基因(FAD3)长度约为1797bp,含有8个外显子和7个内含子,氨基酸377个,转录起始位点位于上游-93-23bp区域,起始碱基为位于-54bp的A。顺式作用元件主要为光响应元件、抗逆响应元件、厌氧诱导响应元件和玉米蛋白代谢响应元件。从麻疯树叶片中克隆FAD3基因,该基因ORF为1134bp,编码377个氨基酸,分子量约为41.1kD,命名为JcFAD3。同源序列比对发现JcFAD3同油桐、白毛杨、蓖麻、大豆和亚麻的氨基酸序列相似性均较高。进化树分析表明,JcFAD3与油桐FAD3的亲缘关系最近。结构分析表明,JcFAD3氨基酸序列含有完整的Deltal2-FADS结构域和Membrane-FADS结构域,三个保守的组氨酸富集区分别位于94位(HDCGH),130位(HRTHH)和297位(HVIHH)。对JcFAD3基因在麻疯树根、茎、叶和叶柄的组织中进行表达分析,结果表明JcFAD3为组成型表达,根中的表达量最高,叶中的表达量最低。麻疯树种子形成过程中,JcFAD3在种子形成的初期和中期表达量逐渐降低,后期表达量上升。植物细胞中三烯酸的含量同植物对温度的敏感性有直接关系。本研究中将麻疯树分别进行4℃和40℃处理,结果发现JcFAD3在不同温度下均有表达,低温情况下,随着处理时间的增加,表达量呈上升趋势；高温情况下,表达量下降,且在整个高温处理阶段,表达量均较低。利用INVScl-pYes2.0酿酒酵母转化体系对JcFAD3基因进行酵母表达研究,气象色谱分析转基因酵母和对照酵母中的脂肪酸含量,结果表明,同对照酵母相比,转JcFAD3基因的酵母菌中多出一个亚麻酸的色谱峰,说明JcFAD3蛋白在酵母中得到了正确的表达,表达产物可以将底物亚油酸转化为亚麻酸。根据植物表达载体pVKH-35S-GUS的多克隆位点特征和麻疯树FAD3基因序列特征,构建了pVKH-JcFAD3过表达载体,采用农杆菌介导法转化野生型拟南芥,PCR鉴定表明获得5株阳性植株。对转JcFAD3基因的拟南芥和野生型拟南芥叶片分别提取脂肪酸,气相色谱分析结果表明,野生型拟南芥和转JcFAD3基因的拟南芥叶片中亚麻酸含量分别为21%和37.5%,说明JcFAD3在拟南芥中得到了正确表达,并提高了转基因拟南芥中亚麻酸的含量。