近年来,由于免疫功能下降人群,包括恶性肿瘤、血液病、艾滋病、SARS、糖尿病、自身免疫病、严重烧伤和创伤、长期吸毒等发病增加:广谱抗生素、免疫抑制剂、皮质类固醇激素在临床上广泛应用；器官移植、导管插管、介入治疗等新技术的普遍开展,使深部真菌感染的发病率急剧上升,成为院内感染死亡的主要原因之一。其中念珠菌感染最常见。1995—2002年美国49所医院连续7年的监测资料表明,念珠菌败血症在医院血源性感染中居第4位,病死率居首位,高达38％-75％。多家医院资料提示白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌四种念珠菌临床分离率较高。　　 由于深部念珠菌感染初期症状不明显,临床表现缺乏特征性,与其他感染相似,导致早期诊断困难,抗真菌治疗延迟。而且深部念珠菌感染病情凶险,发展迅速,贻误治疗时机常致患者死亡,念珠菌血症若不治疗死亡率可以达到45％-76％,已成为艾滋病患者的主要死亡原因。因此快速、敏感、特异地鉴定病原菌对于临床念珠菌感染的诊断和治疗具有重要的意义,能显著提高机会性真菌感染患者的生存率。　　 由于念珠菌属中不同的菌种与菌株对不同抗真菌药物的敏感性有一定差异,例如白色念珠菌、热带念珠菌及近平滑念珠菌对氟康唑保持85％-98％的敏感性,而克柔念珠菌对其天然耐药,医生在临床用药的选择上必须借鉴菌种鉴定的结果,不合理的用药不仅不能消除感染,反而会增加药物的选择压力使耐药菌株凸显出来成为主要致病菌株,造成较严重的临床感染,增加治疗的难度。因而在治疗之前对致病念珠菌进行鉴定具有重要意义。　　 目前,对于深部念珠菌感染,传统的形态学检查、真菌培养和生化鉴定,通常周期长、敏感性差、阳性率低；作为金标准的组织病理学和深部组织培养由于其有创性而难于被患者接受,均已无法满足临床的需要。近年广泛应用的血清学方法以抗原检测为发展方向,对早期侵袭性念珠菌感染的诊断有一定价值,但是由于存在不可避免的假阳性和假阴性,限制了其在临床真菌检测中的应用。　　 因此,如何提高念珠菌感染的早期、特异诊断水平是目前临床真菌学领域的研究热点,也是临床检验中要解决的关键问题。分子生物学技术的发展尤其是PCR技术的迅猛发展为深部真菌感染的早期诊断创造了条件。其中实时荧光定量PCR技术避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差,提高了实验的重复性。与常规PCR相比特异性更强,有效解决了PCR产物污染问题,自动化程度高,敏感性通常达100拷贝/ml,线围宽,重复性好,且检测时间短,对临床标本的要求降低,结果可靠直观,因此是一种非常有效的检测方法。目前,实时荧光PCR已广泛应用于如乙肝病毒和结核杆菌等病原体的检测工作,在病原性真菌检测中的研究也有报道。将其应用于念珠菌感染的检测具有很好的临床意义和应用价值。　　 本研究建立了对四种常见深部念珠菌(白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌)分别或同时进行检测的单重实时荧光定量PCR方法和多重实时荧光PCR方法。　　 第一章单重实时荧光定量PCR方法的建立:在NCBI的Genbank中查找念珠菌属、曲霉菌属、毛霉菌属、隐球菌、人类的18SrRNA、5.8SrRNA、28SrRNA以及ITS1、2基因序列。通过ClustalX软件比对找出白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌的特异性保守序列,选择变异较大且具有种属特异性的ITS2序列用ABI Primer Express3.0软件分别设计针对上述四种常见念珠菌的特异性引物和探针,建立针对这四种念珠菌的单重实时荧光定量PCR方法。白色念珠菌:F15’-TTGTGTTTGGTAGTGAGTGATACTC-3’,R15’-CGAGCAGCAG ATTAATAGAGAAGC-3’P15’FAM d(CGCTCGTGTCCCACATACTGATATGGC)BHQ13’,扩增片段长度为88bp；光滑念珠菌:F25’-TTGTGTTTGGTAGTGAGTGATACTC-3’,R25’-CGAGCAGCAGATTAATAGAGAAGC-3’,P25’CY5d(CGCTCGTGTCCCACATACTGATATGGC)BHQ13’,扩增片段长度为107bp；热带念珠菌:F35’-GCGTCATTTCTCCCTCAAACC-3’,R35’-TAAGTTTCCACGTTAAATTCTTTCAAAC-3’,P35’VIC d(AACCTAGCGTATTGCTCAACACCAAACCCG)BHQ13’,扩增片段长度为82bp；克柔念珠菌:F45’-AGCGGACGACGTGTAAAGAG-3’,R45’-CTCGCAACACTCGCTCTCG-3’,P45’TEXAS RED d(TCGGAGCTGCGACTCGCCTGAAA)BHQ13’,扩增片段长度为117bp。　　 首先对建立的PCR基础体系进行优化,确定四种真菌单重实时荧光定量PCR体系各种成份的最适浓度,白色念珠菌:引物5pmol/体系,探针2pmol/体系,Hotstart Taq DNA聚合酶2U/体系,dNTPs0.2mM/体系,Mg2+3mM/体系；光滑念珠菌:引物浓5pmol/体系,探针1.5pmol/体系,Hotstart Taq DNA聚合酶1U/体系,dNTPs0.3mM/体系,Mg2+3mM/体系；热带念珠菌:引物4pmol/体系,探针1.5pmol/体系,Hotstart Taq DNA聚合酶2U/体系,dNTPs0.3mM/体系,Mg2+2mM/体系；克柔念珠菌:引物4pmol/体系,探针2pmol/体系,Hotstart Taq DNA聚合酶1U/体系,dNTPs0.2mM/体系,Mg2+3mM/体系。　　 其次,在选定的荧光探针靶基因的上下游设计引物,用普通PCR扩增念珠菌标准菌株DNA,产物纯化后连接到pMD19-T vector,得到重组克隆质粒,送往测序证实,建立阳性克隆质粒,用于制作四种单重实时荧光定量PCR的标准定量曲线。　　 然后,用优化好的PCR体系检测六种念珠菌(白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌)、三种其他种属真菌(烟曲霉、新生隐球菌、毛霉菌)、四种细菌DNA(大肠杆菌、肺炎球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌)和人全血DNA,验证荧光定量PCR方法的特异性,结果只有相应的念珠菌DNA有扩增曲线,其它菌株及人DNA均未扩增。建立的四种荧光定量PCR方法最低检测下限均能达到10 copies/ml。将不同浓度DNA样本连续5天进行荧光定量PCR反应,每次各浓度做3个平衡管,检测结果相对偏差均低于10％。说明该方法检测念珠菌DNA的特异性、灵敏度和重复性均好。　　 本研究建立的单重实时荧光定量PCR方法不仅具有高特异性、高灵敏度和很好的准确性,而且省去了电泳、酶切、杂交等后续操作,直接检测PCR过程中荧光信号的变化就可获得定量的结果,操作完全封闭、结果判断更加客观真实、且可对核酸进行定量,因此是一种更方便高效的临床念珠菌感染检测方法。　　 第二章多重实时荧光PCR检测方法的建立:用单重实时荧光定量PCR方法中设计的引物探针,建立可同时检测白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌的中若干种真菌的二重、三重、四重实时荧光PCR方法。由于影响多重PCR的因素较多,例如引物探针的设计、多重PCR反应体系的构建、质量体系的监控等因素均可能导致荧光PCR的灵敏度、稳定性下降,造成检测结果的偏差。因此本研究通过优化建立了如市售预混PCR反应体系那样的多种浓度模板适用的通用型多重荧光PCR反应体系,具体如下:Tris—HCl为50mmol/L,pH值为8.8,KCl为15mmol/L,(NH4)2SO4为8mmol/L,MgCl2为4mmol/L,DMSO加0.5μl,探针浓度为2pmol/体系。二重、三重PCR的Hotstart Taq DNA聚合酶为2U,dNTPs为1mmol/L；四重PCR的Hotstart Taq DNA聚合酶为3U,dNTPs为1.25mmol/L；各种PCR体系中均是引物F1/R1为4pmol/体系,引物F2/R2为5pmol/体系,引物F3/R3为6pmol/体系,引物F4/R4为4pmol/体系。　　 然后实验验证多重实时荧光PCR方法特异性、敏感性和重复性佳,具体步骤同单重实时荧光定量PCR方法。　　 多重实时荧光PCR技术,使众多靶序列的扩增条件一致化,大大方便了多种念珠菌的同时检测,是对实时PCR技术的进一步创新,是多重实时荧光PCR技术在病原检测方面的突破。本研究建立的多重实时荧光PCR方法大大扩展了实时荧光PCR单管检测靶序列的数目,在同一个管中可完成多种念珠菌的同时检测和鉴定,覆盖面广且全,大大节省了时间和操作步骤,在念珠菌检测中有很大的优势。　　 第三章单重实时荧光定量PCR方法和多重实时荧光PCR方法的临床评价。本研究对收集的临床高度疑似念珠菌感染病人493例,标本1042份(血液467份,深部痰液350份,尿液120份,支气管肺泡灌洗液80份,胸水25份)进行单盲检测,并与传统的真菌培养法进行对比,评价单重实时荧光定量PCR方法和多重实时荧光PCR方法的临床诊断效能,并验证其可靠性和准确性。单重实时荧光定量PCR法念珠菌检出率为35.22%(367/1042)；多重实时荧光PCR方法念珠菌检出率为35.03%(365/1042)；真菌培养法念珠菌检出率为31.48%(328/1042)。通过卡方检验进行比较,提示三种方法对念珠菌的检出率无显著性差异(x2=4.131,P=0.127)。对三种检测方法进行两两比较,结果显示单重PCR、多重PCR和真菌培养法的检测一致性较好。　　 用四重实时荧光PCR方法检测念珠菌感染,通过检测结果看出,5种临床标本中检出的各种真菌的构成比无显著性差异(x2=8.321,P=0.76),白色念珠菌感染占优势,明显高于光滑念珠菌、热带念珠菌和克柔念珠菌。不同临床标本中,白色念珠菌(x2=85.352,P<0.01)、光滑念珠菌(x2=20.712,P<0.01)和热带念珠菌(x2=9.902,P=0.042)检出率均有显著性差异,其中白色念珠菌以胸水的检出率最高,其次是痰液；光滑念珠菌以痰液检出率最高；热带念珠菌以胸水检出率最高；而克柔念珠菌检出率无显著性差异(x2=2.034,P=0.729)。提示四重实时荧光PCR方法可用于多种临床标本的检测,适用于临床实验室。　　 实时荧光PCR方法具有检测速度快,高通量,自动化,灵敏度高等特点,可作为传统金标准的必要补充,但不能完全取代真菌培养法。念珠菌的常用检测方法中发生污染的可能性比较大,在DNA提取和真菌培养过程中都可引起假阳性,因此可疑深部念珠菌感染的送检标本最好同时作真菌培养和PCR检测,以提高诊断的准确性。如果真菌培养法和PCR法检测结果一致,可明确诊断,如果两种方法检测结果不一致则要综合分析,必要时进行重复取材。