肝纤维化(liver fibrosis)是由于病毒、代谢、遗传和胆汁淤积等多种原因导致以细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过度沉积为特征的慢性肝损伤。肝纤维化最终导致肝硬化,部分进展为肝癌,因此肝纤维化是一个世界性的公共健康问题。肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)是产生ECM的主要细胞来源,是肝纤维化发生发展的中心环节。肝星状细胞是肝脏的非实质细胞,主要以储存维生素A的静止形式存于正常肝脏中。然而,大量体内外研究发现多种致病因素作用致肝损伤,HSC失去维生素A变为表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的活化的HSC,并不断增殖,分泌丰富的I型胶原而促进肝纤维化的发展。多种细胞因子可以导致HSC增殖和胶原合成,如:血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和转化生长因子-β1 (transforming growth factor beta 1, TGF-β1)。因此,探讨HSC活化增殖的的机制,可能为肝纤维化治疗提供新的思路。肝素结合性表皮生长因子(heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor, HB-EGF)是表皮生长因子受体家族的配体之一,可以结合并激活表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR/ErbB1)和ErbB4受体,进而激活丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号转导通路。最近的研究表明,HB-EGF能够刺激多种细胞增殖。CRM197是一种无毒性的白喉毒素突变体,是HB-EGF的特异性抑制剂,通过结合可溶性的HB-EGF阻断它与ErbB受体的结合和下游的信号反应。细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase, ERK)是MAPK家族成员之一,PDGF和EGF等多种细胞因子通过各自受体激活Ras/Raf/ ERK信号转导通路,传导细胞增殖信号。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/Akt信号通路可被多种生长因子和促有丝分裂原活化,对调控细胞周期、促进细胞分化和细胞生长起重要作用。Ras/Raf/ERK和PI3K/Akt信号通路在HSC的增殖、凋亡和胶原合成中发挥至关重要的作用。本课题旨在研究HB-EGF对两种HSC细胞株(人HSC细胞株LX2和大鼠HSC细胞株T6)和原代HSC增殖和凋亡的影响及可能的分子机制。实验由以下三部分组成:第一部分:HB-EGF在原代大鼠HSC中的表达目的:研究HB-EGF在HSC活化过程中的作用。方法:采用链酶、IV型胶原酶原位灌注肝组织和Nycodenz梯度离心技术分离大鼠原代HSC,采用荧光显微镜和α-SMA做免疫细胞化学染色的方法鉴定原代HSC。用免疫细胞化学和Western blot检测静止和激活的原代HSC中HB-EGF、phospho-EGFR、EGFR和ErbB4的表达;Western Blot检测CRM197干预静止状态的HSC后phospho-EGFR、EGFR和ErbB4的表达。结果:①HSC的细胞的得率为1.5～2.0×107/只,细胞存活率和纯度均大于90%。刚分离的HSC呈圆形,胞浆内含有丰富的脂滴,在波长328 nm的荧光显微镜下观察,能激发出荧光。HSC培养10天,静止的细胞变为活化状态,富含维生素A的脂滴消失,变为梭形或星形。②大鼠原代HSC性质鉴定。未激活的HSC内不表达α-SMA;细胞培养14天后,全部激活的HSC胞浆内呈现α-SMA表达。③HB-EGF及ErbB受体在原代大鼠HSC激活后表达明显增加。刚分离的大鼠原代HSC内几乎不表达HB-EGF及其受体;而激活后的HSC内HB-EGF和ErbB受体表达明显增加。总的EGFR在原代HSC激活前后表达水平无明显差异。④CRM197对静止的大鼠HSC无明显作用。CRM197 (20μg/ml)干预刚分离的大鼠原代HSC,EGFR的磷酸化和ErbB4水平与对照组相比无明显差异。结论:静止状态的原代大鼠HSC内几乎没有HB-EGF的表达,而HSC激活后HB-EGF表达明显增加,HB-EGF在原代HSC激活前后的改变可能预示着肝纤维化与HB-EGF这种细胞因子及其由它激活的下游信号通路密切相关。第二部分:HB-EGF促进HSC增殖、抑制凋亡目的:探讨HB-EGF和CRM197在HSC增殖和凋亡中的作用。方法:HB-EGF不同浓度(10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml)和时间点(12 h, 24 h, 48 h)干预活化的人HSC株LX2、大鼠HSC株T6和原代大鼠HSC,四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)比色法检测细胞增殖变化、溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine, BrdU)标记的掺入法测定细胞DNA合成。以20μg/ml CRM197、5μmol/L AG1478、50μmol/L PD98059和25μmol/L LY294002同时干预经HB-EGF (40 ng/ml)刺激的HSC-LX2、T6和原代大鼠HSC,MTT检测细胞增殖变化、BrdU掺入检测HSC DNA合成。CRM197预处理细胞24小时后更换培养基,给予HB-EGF 40 ng/ml干预LX2和T6和原代大鼠肝星状细胞24 h,透射电镜观察细胞形态学改变。末段脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末段标记(terminal deoxynucleotidy transferrase UTP-nick end labeling, TUNEL)检测HSC凋亡。CRM197预处理细胞24小时后,给予HB-EGF (10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml)干预HSC-T6和LX2细胞株12 h,24 h和48 h。膜联蛋白(Annexin-V)/碘化丙啶(Propidium iodide, PI)联合标记流式细胞术检测HSC凋亡率和Caspase-3活性。以20μg/ml CRM197、5μmol/L AG1478、50μmol/L PD9805925和25μmol/L LY294002同时干预经HB-EGF (40 ng/ml)刺激的HSC-LX2、T6和原代大鼠HSC,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:①HB-EGF能刺激人HSC株LX2、大鼠HSC株T6和原代HSC增殖。MTT检测显示不论CRM197抑制与否,HB-EGF均呈浓度和时间依赖性的刺激以上三种细胞增殖,其中HB-EGF高剂量组(40 ng/ml)干预24 h,使LX2、T6和原代HSC细胞增殖分别较对照组的100%增加至137.11±8.44% (P<0.05)、138.74±6.21% (P<0.05)和129.92±4.68% (P<0.05);CRM197能抑制HB-EGF刺激后引起的HSCs增殖。②PDGF (20 ng/ml)刺激三种HSC增殖与HB-EGF (40 ng/ml)刺激增殖的作用相比无明显差异;CRM197发挥了与EGFR受体阻断剂类似的抑制作用。AG1478显著抑制了HB-EGF刺激的HSC增殖,与CRM197的抑制作用相比无明显差异;PD98059和LY294002均分别显著抑制了HB-EGF刺激后HSCs的增殖,与CRM197的抑制作用相比显著增加。③HB-EGF呈浓度和时间依赖性地刺激HSC DNA合成。BrdU-DNA掺入法测定结果显示HB-EGF高剂量组(40 ng/ml)干预24 h,使LX2、T6和原代HSC细胞DNA合成分别较对照组的100%增加至160.77±13.62% (P<0.05)、154.33±5.55% (P<0.05)和130.92±1.74% (P<0.05);CRM197能够明显抑制HB-EGF刺激后引起的HSC DNA合成。④CRM197抑制人HSC株LX2、大鼠HSC株T6和原代HSC DNA合成,较HB-EGF刺激组相比明显降低(68.87±5.57% vs 160.90±13.57%, P<0.05; 74.67±4.43% vs 154.33±5.55%, P<0.05; 76.30±6.85% vs 130.92±1.74%, P<0.05);AG1478、PD98059和LY294002均分别显著抑制了HB-EGF刺激后HSC的DNA合成。⑤透射电镜下观察HSC形态变化。浓度为20μg/ml的CRM197干预HSC 24 h后,细胞呈现凋亡特征:细胞体积变小,染色质凝集,新月体形成,核膜皱褶,粗面内质网扩张。⑥与对照组相比,20μg/ml CRM197分别提高LX2、T6和原代HSC细胞TUNEL染色阳性细胞率8.87倍(P<0.05), 7.54倍(P<0.05)和6.54倍(P<0.05)。⑦HB-EGF抑制Caspase-3活性;20μg/ml CRM197分别将LX2、T6和原代HSC细胞Caspase-3的活性提高了1.56倍(P<0.05), 1.65倍(P<0.05)和1.70倍(P<0.05)。结论:HB-EGF能够刺激HSC增殖和DNA合成;CRM197能够诱导HSC凋亡,这种作用可能与Caspase-3的活性相关。第三部分:HB-EGF对肝星状细胞增殖与凋亡影响的信号转导机制目的:探讨HB-EGF对HSC细胞内ErbB受体以及下游的ERK和Akt信号转导通路的调节作用。方法:HB-EGF或CRM197干预HSC 24 h后,免疫细胞化学和Western blot检测EGFR、ErbB4和p-EGFR的蛋白表达变化。经或不经CRM197 (20μg/ml)干预HSC 24 h后,以不同浓度的HB-EGF (10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml)刺激HSC-T6、LX2细胞株和原代大鼠HSC 24 h,Western blot检测EGFR、ErbB4、ERK、Akt、p-EGFR、p-ERK和p-Akt的蛋白表达变化;RT-real time PCR测定EGFR和ErbB4 mRNA的表达。经或不经CRM197 (20μg/ml)干预HSC 24 h后,以HB-EGF (40 ng/ml)刺激HSC-T6、LX2细胞株和原代大鼠HSC 12 h,24 h和48 h,Western blot检测EGFR、ErbB4、ERK、Akt、p-EGFR、p-ERK和p-Akt的蛋白表达变化;RT-real time PCR测定EGFR和ErbB4 mRNA的表达。以20μg/ml CRM197、5μmol/L AG1478、50μmol/L PD98059和25μmol/L LY294002同时干预经HB-EGF (40 ng/ml)刺激的HSC-LX2、T6和原代HSC,横向比CRM197与三种抑制剂对以上信号分子的作用。结果:①在HSC细胞核和细胞浆中均表达ErbB受体,HB-EGF能刺激HSC中p-EGFR和ErbB4表达增加;CRM197抑制p-EGFR和ErbB4的表达。②HB-EGF刺激HSC中ErbB4 mRNA水平表达增加;EGFR mRNA水平在原代HSC的各组间变化不明显。③HB-EGF上调两种HSC细胞株(LX2、T6)和原代HSC中ErbB受体和下游的ERK、Akt信号分子磷酸化水平,呈时间和剂量依赖性;CRM197抑制HB-EGF激活的LX2、T6和原代HSC内ErbB受体的表达,继而抑制了ERK和Akt信号通路的磷酸化。④CRM197发挥了与EGFR受体相应阻断剂类似的抑制作用。AG1478抑制了HB-EGF刺激后EGFR受体的磷酸化水平,继而抑制了下游的ERK和Akt信号分子的磷酸化水平,而CRM197则同时抑制了EGFR受体的磷酸化和ErbB4受体。⑤CRM197发挥了与ERK和Akt信号通路相应阻断剂类似的抑制作用。PD98059和LY294002均分别显著抑制了HB-EGF刺激后HSC内ERK和Akt信号分子的磷酸化水平,而CRM197则同时抑制了HB-EGF刺激后这两条信号通路的磷酸化,但是与PD98059和LY294002的抑制作用相比显著降低。结论:HB-EGF可能通过EGFR和ErbB4受体,激活ERK和Akt两条细胞内信号转导通路,实现促进HSC增殖、抑制HSC凋亡的作用。